| 研究課題/領域番号 |
25460542
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 宮崎大学 |
|---|
研究代表者 |
小椋 義俊 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 助教 (40363585)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | 腸管出血性大腸菌 / O157 / non-O157 EHEC / 志賀毒素 / ファージ |
|---|
| 研究概要 |
腸管出血性大腸菌(EHEC)の主要な病原因子は志賀毒素(Stx)である。Stxには、Stx1とStx2が存在する。特にStx2が重症化リスクファクターであるが、Stx2産生量は血清型や株ごとに異なる。stx遺伝子はファージ上にコードされているが、申請者は、Stx2ファージには高度なゲノム多様性が存在すること、Stx2ファージはいくつかのタイプに分類でき、そのタイプによってStx2産生量が異なることを先行研究で明らかにしている。本研究では、O157を含む主要な血清型のEHEC 約600株について、大規模な高解像度系統解析とStxファージのタイピングを行い、Stx2高産生型ファージを持つ株が分布する血清型とその系統を明らかにする。さらに、患者の症状などのメタ情報も統合し、EHECハイリスク系統の同定を試みる。
H25年度は、主にO157の菌株収集とシーケンスを行った。全国６カ所の地方衛生研究所の協力を得て、過去１０年間に分離されたO157を約300株収集した。現在までに、MiSeqによるシーケンス、全ゲノム情報に基づく高解像度系統解析、Stx2ファージのサブタイピングまでを終了しており、Stx2高産生型ファージを保有する４つのO157クレードを同定した。現在、これらの株についてStx2産生量の定量を行っているところである。また、non-O157 EHECについては、100株の収集を終えており、現在、追加で収集しているところである。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H25年度は、研究計画通り、約300株のO157の収集、シーケンス、高解像度系統解析、Stx2ファージサブタイピングまでを終えており、Stx2高産生型ファージを保有する４つの主要系統を同定した。non-O157 EHECについては、300株収集する予定であったが、現在までに100株の収集にとどまっている。non-O157 EHECでは、O157比べ症例数が少ないこととStx2陽性株の割合が少ないために、多数の菌株の収集は難航しているが、より多くの地方衛生研究所に協力を要請し、H26年度中には300株の収集を目指す。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後は、残りのnon-O157 EHECの収集に加えて、研究計画書通りに、以下の解析を行う。
(1) non-O157 EHEC の300株の次世代シーケンサによるゲノム配列の取得と高解像度系統樹の作製：O157と同様にMiSeqを用いてゲノムシーケンスを行う。申請者は、以前にO26, O111, O103の全ゲノム配列を決定しており、現在、O145、O121、O165についても、全ゲノム配列を決定中である。これらの配列をレファレンスとして、SNPsを同定し、高解像度系統樹を作成する。
(2) non-O157 EHECの300株のStx2ファージのサブタイピング：O157の解析により構築した方法で、各non-O157 EHECのStx2aファージタイピングを行う。
(3) O157 300株とnon-O157 EHEC 300のStx2産生量の定量：ラテックス凝集反応法(VTEC-RPLA, デンカ生研)を用いて、Stx2産生量を測定する。先行研究で同定したStx2高産生型ファージφStx2a_β2を保持する株のStx2産生量が他より有意に高いことを確認するとともに、新規のStx2aファージタイプの中から、Stx2産生量が高いものが同定されることも期待される。
(4)EHECハイリスク系統の同定と迅速識別法の確立：各血清型の系統間での重症化率の統計解析を行い、EHECハイリスク系統を同定する。Stx2高産生型ファージ保有株が分布する系統とEHECハイリスク系統が一致することを想定しているが、一致した場合は、Stx2ファージタイプ（Stx2産生性）が重症化に強く関与していることが証明できる。各ハイリスク系統に特異的な遺伝子をMiSeqデータから抽出し、それをPCRで検出する系とStx2aファージタイピング系を組み合わせることで、EHECハイリスク系統の迅速識別法を確立する。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
当該年度にnon-O157 EHECを300株収集する予定であったが、100株の収集にとどまった。そのため、菌株の輸送・培養・保存に関わる費用が不要となった。
次年度に、残りの200株の菌株収集を行うため、その分の経費が必要となる。
|
