| 研究課題/領域番号 |
25460543
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 帝塚山大学 |
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研究代表者 |
藤原 永年 帝塚山大学, 現代生活学部, 教授 (80326256)
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| 研究分担者 |
綾田 稔 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (90222702)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 糖ペプチド脂質 / 非結核性抗酸菌症 / M. intracellulare / 宿主応答 |
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| 研究概要 |
本研究では、MAC菌が感染宿主内で特異糖ペプチド脂質抗原であるglycopeptidolipide (GPL) のアセチル基修飾の変化により、宿主免疫応答から逃避して長期生存を可能にすることを分子機序から実証したい。本研究の初年度においては、非結核性抗酸菌症の臨床分離株Ku11株の細菌学的性状から菌種を同定すること、産生するGPLを高純度に精製し、化学構造を決定することを中心に実施した。DDHマイコバクテリア極東（極東製薬株式会社、茨城）及びAmplicor Mycobacterium PCR（ロシュダイアグノスティックス株式会社、東京）により菌種を同定した。また、分類学的に16S rRNA, rpoB, hsp65の相同性試験から系統樹を作成してMycobacterium intracellulareであることを確認した。7H11寒天培地で培養した菌体を集菌し、Forch法に準じて総脂質画分を抽出した。弱アルカリ加水分解を施してアルカリ安定脂質を回収し、アセトン沈澱法、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーによりKu11株特異GPLを精製純化した。MALDI-TOF/MS（分子量決定）、MALDI-TOF/MS-MS（糖配列決定）、GC/MS（糖のアルジトールアセテート誘導体から糖の分子種・結合位置決定）、NMR（アノマー体決定）等の各種分析からKu11株特異GPLの糖鎖構造をα-Rha-(1→3)-2-O-Me-α-Rha-(1→3)-α-Rha-(1→3)-α-Rha-(1→3)-α-Rha-(1→2)-6-d-α-Talと決定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
非結核性抗酸菌症の臨床分離株であるKu11株がMycobacterium intracellulareであることを分類学的に同定できた。本菌が予備検討から推定していた構造の特異GPLを産生することが明らかとなった。次のステップとして生合成遺伝子の解析を行うことが可能になった。また、天然型GPLは色々なパターンでアセチル基が付加していると考えられ、各パターンのGPLの精製とアセチル基の位置決定が重要であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の最終目標はGPL構造が宿主応答に及ぼす影響を解明することである。当研究室保存のMycobacterium smegmatis J15cs株はGPLを欠損しているが、GPL生合成遺伝子のひとつmps1における18塩基脱落が原因であることを最近明らかにした。この相補菌の宿主内での生存性や病原性はGPLの存在が宿主応答に関与していることの証となる。並行して検討していきたい。また、rtfA遺伝子を指標にGPL生合成遺伝子群のクローニングを行い、特に糖鎖合成について解明したい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
DNAシークエンス、NMR分析を外注せずに行ったため、謝金が抑えられた。また、菌の同定、GPLの構造解析が順調に進んだため消耗品が有効的に利用できた。以上より、当初の計画より支出を抑えることができた。
マウスを利用した実験において、KOマウスの検討を追加する。KOマウスや抗体の購入等、消耗品購入に使用する。
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