| 研究課題/領域番号 |
25460553
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
秋庭 正人 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究所・細菌・寄生虫研究領域, 主任研究員 (60355211)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | Salmonella Typhimurium / 薬剤耐性 / ゲノミックアイランド / 多コピー化 / blaCMY-2 |
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| 研究概要 |
本研究では国内の牛から分離されたSalmonella Typhimurium（ST）VII型菌が染色体上に保有するGI-VII-6（GI）の多コピー化に基づく耐性増強機構の詳細を明らかにすることを目的としている。今年度はGIの多コピー化がgene duplication and amplification（GDA）の機構によることを示すために以下の実験を行った。
GIを保有するST L-3553株の最小発育阻止濃度（MIC）より高い、12.5、25、50、100 μg/mlのセフォタキシム（CTX）を含む寒天平板上で同株を培養したところ、12.5 μg/ml で10の-6乗、25μg/mlで10の-8乗の頻度で耐性コロニーが出現したので、それぞれ20株を分離、凍結保存した。50 μg/ml以上の濃度では耐性コロニーは出現しなかった。これら派生株のCTXに対するMICを測定したところ、親株の4～16倍、高い値を示した。blaCMY-2のコピー数とmRNA発現量は親株の6～86倍に増加し、両者の間に高い相関が認められた。すなわち、耐性増強はblaCMY-2コピー数の増加に伴うmRNA量の増加に基づくことが示唆された。また、多コピー化の様式を明らかにするため、GI内外遺伝子のコピー数を測定したところ、GI全長（125 kb）が多コピー化している株と一部が多コピー化している株が認められた。また、多コピー化が直列に起こっているかどうかを明らかにするため、サザンブロット解析を実施したところ、すべての株で直列増幅に特徴的なシグナルの存在を確認できた。以上の結果から、25 μg/ml以下の濃度のCTX存在下ではGI全長または一部がGDAの機構により直列に多コピー化し、blaCMY-2遺伝子の発現量が増加する結果、耐性が増強されることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的はGI-VII-6の多コピー化に基づくSalmonella Typhimuriumの耐性増強機構の詳細を明らかにすることである。今年度は多コピー化がgene duplication and amplificationの機構によることを示す目的で実験を行い、初期の結果を得た。これらの成果について現在、論文作成中であり、次年度には印刷できる見込みである。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度研究により、GI-VII-6（GI）の多コピー化に基づく耐性増強現象の全体像を明らかにすることができた。今後、詳細なメカニズムの解析を行うにあたり、多コピー化に関与する因子を同定する必要がある。そのためにはまず、GI保有菌の全ゲノム塩基配列を明らかにしなければならない。次年度は今年度実験で使用したSalmonella Typhimurium L-3553株の全ゲノム塩基配列を決定し、多コピー化株の網羅的遺伝子発現解析を実施する。これにより、多コピー化に伴い発現の増加する遺伝子と減少する遺伝子が明らかとなり、メカニズム研究の標的とすべき遺伝子を絞り込むことができる。
L-3553株のゲノム解析では次世代シークエンサーによる配列取得後、アッセンブルを行う。予想されるギャップはPCR増幅後、サンガー法で塩基配列を決定する。L-3553株の全ゲノム塩基配列決定後、６株程度の耐性増強株についてマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を実施する。
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