| 研究課題/領域番号 |
25460563
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
後藤 敏 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (00211920)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ヒトメタニューモウイルス / 中和抗体価測定法 / 組換えウイルス / ルシフェラーゼ / 緑色蛍光色素 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は、緑色蛍光色素（GFP）とRenilla luciferase（Rluc）を発現する組換えウイルス(rHMPV-Rluc/GFP)を作成した。多段増殖しない条件下（トリプシン非存在下）でも、本ウイルス粒子を10個程度感染させれば、翌日には判定可能なluciferase(luc)活性を検出できることが明らかとなった。今年度は、rHMPV-Rluc/GFPを使って迅速中和抗体価測定法 (Rluc-NA法)の確立を目指した。
その結果、Rluc-NA法では、従来、５日から１週間ほどかかっていた抗体価測定が24時間以内に完了できるようになった。また、従来法ではアガロースの重層や多段増殖に必要なトリプシンの添加のほか、免疫染色など煩雑な操作が必要だったが、それらが省略できるようになった。
Rluc-NA法の抗体価測定の精度を調べるため、GFPを発現する組換えウイルス(rHMPV-GFP)による中和抗体価測定法（GFP-NA）と比較した。GFP-NA法では感染後７日目のGFP発現を指標に抗体価を決定した。両者による抗血清の中和曲線は、ほぼ同等の曲線が得られた。本実験で使用された抗血清は、免疫沈降法の結果から、主にHMPV Fタンパク質に対する抗体が含まれていることが明らかとなった。また、Rluc-NA法とGFP-NA法で調べられた中和活性は、血清中のIgG分画を除くと喪失することから、IgGによるものであることが確認できた。次にヒト血清23サンプルについてRluc-NA法とGFP-NA法により中和抗体価を決定した。二つの間で、抗体価の陽性と陰性の判断は完全に一致し、false positiveやfalse negativeは認められなかった。抗体価の値も相関係数0.83で極めてよく相関した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究での主要な目的は、HMPV中和抗体価測定法の迅速化と簡便化である。今回確立したRluc-NA法により、中和抗体価は24時間以内に測定できるようになった。また、培養液中にトリプシンやアガロースを添加する必要がなくなったばかりか、免疫染色も省けるようになり、操作の簡便化も図られた。こうして概ね目的は達成できたと考える。
その一方、多量検体を扱えるようにするためには、分泌型lucや、より高感度なlucを使った測定法が必要であり、次年度の課題となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回確立したRluc-NA法をさらに迅速で簡便な測定法に改良するため、より高感度なluc遺伝子とその分泌型luc遺伝子を利用することを考える。そのため、高感度lucや分泌型lucを発現するrHMPVを作成する。具体的には、①Gaussia luciferase (Gluc)/GFP発現rHMPV、②Cypridina luciferase (Cluc)/GFP発現rHMPV、③Oplophorus gracilirostris luciferase (Oluc)/GFP発現rHMPVをリバースジェネティクス法により作製する。GlucとClucは分泌型、Olucは分泌型と非分泌型を作成する。それぞれの組換えウイルスについて、luc活性が感染後何時間で検出できるかを調べ、中和抗体価測定に適したウイルスを選択する。分泌型lucを使えば、細胞溶解の必要がなくなるので、多量検体に適した簡便な方法となることが期待される。また、これらのウイルスの中から、一次転写による翻訳産物を検出できる感度のよいlucを産生するウイルスに着目し、一次転写系解析に応用することも考えていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
5万円ほどの次年度使用額が生じた。これは、平成26年度の学会発表に関わる旅費を校費である学内教育研究経費から支出したことによる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の学会、論文発表への経費として使用する予定である。
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