| 研究課題/領域番号 |
25460573
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
博多 義之 近畿大学, 医学部, 講師 (30344500)
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| 研究分担者 |
宮澤 正顯 近畿大学, 医学部, 教授 (60167757)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | HIV-1 / オートファジー / Vpr |
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| 研究実績の概要 |
これまでにVprはオートファジーシステムを正負の両面で制御する仕組みを持つこと、すなわちウイルス複製に伴うオートファジーを積極的に利用するための分子スイッチとしてVprが機能しうること、およびG2期停止など既報のVprの機能とは相関せず、既知機能の発揮の際に利用する分子装置をオートファジー制御には使用しないことなどを明らかにした。また、Vpr依存的オートファジー制御に関わる宿主因子の同定に挑戦した。特にTAP法による同定の試みにおいて、本法の細胞に与える毒性が問題であった。そこで、平成26年度では、オートファジー制御にかかわるVprのペプチド領域を適切なスペーサーを保持するビオチン化ペプチドとして化学合成し、これをベイトにしたpull down法により因子の同定を試みた。その結果、様々な新規のVpr結合性因子を同定できた。その中にはオートファジーへの関与が報告されていない分子群も含まれており、現在解析を続けている。別に、オートファゴソーム形成誘導に関わる既知の宿主因子との特異的な結合も検出しており、Vprがオートファジーを正に制御する機構の実体であると考えられる。さらにオートファジーを負に制御する分子機構の解明のために、オートファゴソームからオートリソソームへの成熟過程を種々のマーカータンパク質により追跡した。その結果、リソソームとの膜融合に必要とされるStx17のオートファゴソーム膜への動員までは正常に進行しているが、それ以降の過程に不全があることが示唆された。また、マクロファージ、樹状細胞、および神経細胞におけるVpr依存的オートファジー制御の検出のために、リコンビナントVpr (rVpr)の精製を試みた。大腸菌から精製することを試みたものの精製度の高いものが採取できなかったため、現在ではコムギ胚芽系の利用など別の方法での精製を試みている段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本申請研究期間内(平成25年-27年度)では、Vpr依存的オートファジー制御に関与する宿主因子の同定、制御のための分子機構の解明、HIV-1複製/エイズ病態における制御の意義の解明を目的としている。また、マクロファージや神経細胞におけるVpr依存的オートファジー制御の有無、およびその制御が細胞生理等に与える影響について解析し、エイズ病態との関連性を明らかにすることを第2の目的に挙げている。平成26年度までにオートファジー制御のための宿主因子の同定と分子機序の解明に着実に迫っている。当初、Vprのオートファジー制御についてはオートファジーの抑制を行うのみと予想していたが、実際は正負の両面で行われているという新知見が得られた。そのため、制御のために働いている宿主因子の同定および制御のための分子機序の解明には予測していたよりも倍近く多い解析が必要となったが、両方の機序について分子レベルでの理解が順調に蓄積している。また、オートファジーを正に制御するためにVprが直接結合する標的宿主因子についても実体が明らかにされつつある。一方、マクロファージおよび神経細胞におけるVpr依存的オートファジー制御の有無を検討するために必要となるリコンビナントVprタンパク質の調整が予想より難航している。大腸菌において大量に発現はするものの精製の過程において不溶性分画からの回収が非常に困難であった。また、精製度も十分なものが得られなかった。現在、別の発現系を試みており、調整が可能になりつつある。調整後は各細胞におけるオートファジー制御の有無、特に神経細胞においてはマイトファジー制御の有無、およびそれら細胞の細胞生理に与える影響が一気に解明されると期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
Vpr依存的オートファジー制御の分子機構解明に向けて引き続き研究計画に沿い研究を遂行する。まず、Vprがオートファジーを正に制御するために相互作用すると考えられる宿主因子（平成26年度に同定した1因子）について、引き続き機能解析を進める。この因子はオートファジーへの関与が既知であるため、相互作用する他の宿主因子群も明らかとされている。それら既知の分子間相互作用がVprによりどのように修飾されるのか調べる。また、負に制御するための機序を、特にStx17のオートファゴソーム膜動員以降の過程に着目し、詳細に解析する。さらに、Vpr由来ペプチドを利用したpull down法により平成26年度において同定した様々な宿主因子のオートファジー制御能について、当該因子のsiRNAを用いて解析する予定である。
HIV-1複製におけるVpr依存的オートファジー制御の役割を解明するために、まず感染の標的であるT細胞とマクロファージにVpr依存的オートファジーが認められるのかを調べる。さらに、Vprによるオートファジー制御がウイルス複製のどの段階で働いているのか解析する。その際は、野生型HIV-1分子クローンおよびVprを欠損したウイルス分子クローンなどを利用して複製後期段階を評価する。また、Vprを含有するあるいは含有しないHIV-1ウイルス粒子などを使用することで複製の前期段階を評価する。
さらにrVprを利用して樹状細胞と神経細胞におけるVpr依存的オートファジー制御の有無、および制御が細胞生理に与える影響を調べる。特に神経細胞においてはマイトファジー制御および細胞死との関連に着目する。現在、大腸菌とは別のシステムでrVprの発現および精製を試みており、順調に精製されつつある。精製後上記解析を実行することで、エイズ病態とオートファジー制御の関連性を明らかにする。
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