| 研究課題/領域番号 |
25460580
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
石井 孝司 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (40280763)
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| 研究分担者 |
李 天成 国立感染症研究所, その他部局等, 主任研究官 (90370957)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | E型肝炎ウイルス / 複製機構 / 病原性 / レプリコン |
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| 研究実績の概要 |
近年、E型肝炎ウイルス（HEV）を培養細胞系で増殖させる系が確立されたが、ウイルスの増殖は非常に遅く、ウイルスの複製機構や病原性、トロピズムを解明する上で、効率のよいHEVの増殖系を確立することが望まれている。この目的を達成するため、我々は感染性のHEV cDNAクローンからレプリコンの構築に成功し、HEV増殖の詳細な解析を行うことが可能になっている。
本年度は、このレプリコンの系を用いてHEV増殖に影響を与える因子の探索を行った。また、複製に重要な機能を担っていると考えられる非構造蛋白中のプロテアーゼ領域について、無細胞蛋白発現系での発現を試みた。
ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として持つレプリコンRNAをトランスフェクションした細胞でLOPAC化合物ライブラリー（約1,200）のスクリーニングを行ったところ、MTTアッセイで強い毒性が見られず、20μMでも阻害活性が認められた化合物が17存在した。その中に、細胞培養系でHEV増殖阻害効果が報告され、慢性E型肝炎の治療にも実際に使われているリバビリンが含まれていた。一方、レプリコンの複製を促進する10の化合物も見出された。
また、東京大学創薬オープンイノベーションセンターの化合物ライブラリーについてもスクリーニングを開始した。2058化合物のスクリーニングを行い、20μMで50％以下に低下させる薬剤が157、20％以下に低下させる薬剤が33見出された。これらの化合物の作用機序を調べ、HEV複製メカニズムを解析する。
一方、まだ明らかにされていない非構造蛋白のプロセシングについての検討も開始した。毒性の強い蛋白であるプロテアーゼ領域について、コムギ胚芽を用いた無細胞蛋白発現系での蛋白発現に成功した。本蛋白のプロテアーゼ活性を調べ、非構造蛋白のプロセシングの解析、宿主蛋白で本プロテアーゼの基質となっている因子の探索を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
レプリコンの構築に成功し、HEVの複製を阻害する化合物のスクリーニングを順調に実施できている。今後、これらの化合物の作用機序を調べ、HEV複製機構にどう関与しているかを調べる。また、毒性が強くこれまで発現が非常に難しかったプロテアーゼ領域を大量に発現できる技術が確立したことから、これまでわかっていなかった非構造蛋白のプロセシング機構の解明が期待できる。また、プロテアーゼが宿主蛋白に及ぼす機能についても解析を行うことが可能になると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
HEVの複製を阻害する化合物を複数見出した。今後、これらの化合物の作用機序を調べ、HEV複製機構にどう関与しているかを調べる。また、阻害剤のin vivoでの効果の検討を行い、E型肝炎治療薬としての可能性を検討する。一方、無細胞蛋白発現系を用いることによりプロテアーゼ領域を大量に発現できることから、この組み換え蛋白を用いてプロテアーゼ機能の解析、非構造蛋白のプロセシングの詳細な解析を行う。また、このプロテアーゼが宿主蛋白に作用している可能性についても検討し、HEVの病原性に何らかの作用を及ぼしている可能性についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末納品等にかかる支払いが平成２７年４月１日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。
平成26年度分についてはほぼ使用済みである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記のとおり。
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