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2013 年度 実施状況報告書

アミン反応性同位体タグによる血清タンパク質ストレス損傷の定量

研究課題

研究課題/領域番号 25460684
研究種目

基盤研究(C)

研究機関滋賀医科大学

研究代表者

石田 哲夫  滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (10176191)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード血清タンパク質 / アミノ酸 / ダブシルクロリド / 安定同位体ラベル / 質量分析 / 比較定量 / 液体クロマトグラフィー / 血清アルブミン
研究概要

アミノ酸混合液の定量精度と信頼性は、ダブシルクロリドによるアミノ基ラベル反応の効率と再現性に大きく依存する。反応のpHが高いほどアミノ基の反応性が高くなるが、ダブシルクロリドの加水分解反応も加速され、大過剰に加えたつもりのラベル剤が急減する。本研究では、非水溶媒を含めたラベル反応の最適な条件を見つけることを研究前半の重要課題として取り組んでいる。この問題は、広く利用されている様々なアミノ基ラベル試薬に共通する課題で、サンプル中に含まれるアミノ酸の濃度に100倍以上の差がある場合には特に重要である。今年度は、サンプルをpH9の重炭酸ナトリウム水溶液に溶解する水系条件について、13C2-グリシンを内部標準とし、同一サンプルを13C0-、13C6-、13C12-ダブシルクロリドでラベルして比較定量することにより問題点の抽出を行った。
ダブシルラベルアミノ酸を分離・定量する方法として、今年度は、①ミクロ逆相系カラムによるキャピラリー液体クロマトグラフィーによる分離、②ダブシル基の可視部吸収(430 nm)を利用した検出、③ ②に引き続きエレクトロスプレーイオン化(ESI)によるイオン化とイオントラップ型質量分析装置での3つのサンプル由来アミノ酸の分離と比較定量(LC-Vis-ESI-MS)を開発し、トリプルタグによる定量原理を検証した。
血清アミノ酸分析用の市販のアミノ酸標準混合液、糖尿病モデルラットとそのコントロールラットの血清を試験サンプルとして、ラベル反応とLC-Vis-ESI-MSによる比較定量を評価した。質量スペクトルの生データから、指定した質量電荷比(m/Z)を持つイオンのクロマトグラムを自動的に生成するPCプログラムも作成した。
また、ヒト血清アルブミンとの複合体の結晶構造がPDBに登録されているダンシルアミノ酸について、結合曲線を測定し学会で報告した(論文作成中)。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、ダブシルクロリドによるラベル反応条件の検討が水系の範囲に限定されており、当初に計画していた非水溶媒での検討ができなかった。
しかし、本研究を進める中で、①発現させたタンパク質の一部に予期しない共有結合性修飾(リン酸化など)が起こる、②抗体医薬などのタンパク質製剤の品質管理、などで当該タンパク質に起こっている修飾の程度と部位を決める方法が求められていることが分かった。そこで、本年度の後半で、安定同位体ラベルダブシルクロリドによるトリプルタグを、アミノ酸のみでなく、ペプチドにも応用できるかの検討を始めた。
従って、総合的に見ると、本研究は順調に進展している。

今後の研究の推進方策

(1)ダブシルクロリドによるラベル反応条件を、遊離型アミノ酸だけでなくトリプシン消化で得られるペプチド混合物についても、非水溶媒系を含めて定量的に検討し、アミノ酸混合物とペプチド混合物のそれぞれについて、最適なラベル条件を決定する。
(2)次に、平成25年度に13C6アニリンから合成した約15 gの13C6スルファニル酸から、可能な限り高い収率で13C6ダブシルクロリドを合成する。合成最終ステップのメチルオレンジの塩素化の収率が低く、この固相反応におけるメチルオレンジのプロトン化の程度と水分含量が重要であることが分かっているので、まず、市販のスルファニル酸からの合成でこれらの条件の最適化を行う。
(3)ヒト血清アルブミンとラット血清アルブミン(糖尿病モデルラットとそのコントロールラットから個体別に継時的に採血した血清から精製する)について、嫌気チャンバーの中で塩酸蒸気加水分解を行い、実際にアミノ酸組成の比較定量がどの程度の精度で可能か検証する。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 1件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian deevelopment during sexual induction2014

    • 著者名/発表者名
      Maezawa, T., Tanaka, H., Nakagawa, H., Ono, M., Aoki, M., Matsumoto, M., Ishida, T., Agata, Y., Horiike, K., Kobayashi, K.
    • 雑誌名

      Mechanism of Development

      巻: 132 ページ: 69-78

    • DOI

      10.1016/j.mod.2013.12.003

    • 査読あり
  • [雑誌論文] immunohistochemical localization of D-serine dehydratase in chicken tissues2014

    • 著者名/発表者名
      Nishimura, Y., Tanaka, H., Ishida, T., Imai, S., Matsusue, Y., Agata, Y., Horiike, K.
    • 雑誌名

      Acta histochemica

      巻: 116 ページ: 244-249

    • DOI

      10.1016/j.acthis. 2013.12.011

    • 査読あり
  • [学会発表] 大腸菌ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの嫌気下での精製と機能解析2014

    • 著者名/発表者名
      吉岡博史、石田哲夫、谷泰史、三原久明
    • 学会等名
      日本農芸化学会2014年会
    • 発表場所
      明治大学生田キャンパス
    • 年月日
      20140327-20140330
  • [学会発表] Escherichia coli由来ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのnFeS2鉄硫黄クラスターに配位するアミノ酸残基の役割2013

    • 著者名/発表者名
      谷泰史、吉田吉孝、秀瀬涼太、斎藤茂樹、中島洋、渡辺芳人、石田哲夫、田中裕之、堀池喜八郎、栗原達夫、江崎信芳、三原久明
    • 学会等名
      第86回日本生化学会大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜
    • 年月日
      20130911-20130913
  • [学会発表] 補酵素FADの構造変化がフェレドキシン還元酵素BphA4の全体構造変化に与える影響2013

    • 著者名/発表者名
      千田美紀、西澤明人、木村成伸、石田哲夫、福田雅夫、千田俊哉
    • 学会等名
      第86回日本生化学会大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜
    • 年月日
      20130911-20130913
  • [学会発表] 脊椎動物の進化とD-セリン代謝2013

    • 著者名/発表者名
      田中裕之、石田哲夫、西村嘉洋、坂本健補、堀池喜八郎
    • 学会等名
      第86回日本生化学会大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜
    • 年月日
      20130911-20130913
    • 招待講演
  • [学会発表] 安定同位体標識ダブシルクロリドを利用したアミン類代謝動態解析2013

    • 著者名/発表者名
      石田哲夫、田中裕之、西村嘉洋、坂本健補、堀池喜八郎
    • 学会等名
      2013年度酵素・補酵素研究会
    • 発表場所
      立命館大学びわこ・くさつキャンパス
    • 年月日
      20130621-20130622
  • [学会発表] ヒト血清アルブミンへのダンシルアミノ酸の結合機構2013

    • 著者名/発表者名
      石田哲夫、田中裕之、西村嘉洋、坂本健補、堀池喜八郎
    • 学会等名
      第13回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      とりぎん文化会館
    • 年月日
      20130612-20130614
  • [学会発表] 質量差6のトリプルタグによるアミノ基含有化合物の精確な定量2013

    • 著者名/発表者名
      石田哲夫
    • 学会等名
      BIO tech 2013 アカデミックフォーラム
    • 発表場所
      東京ビッグサイト
    • 年月日
      20130508-20130510
  • [図書] Advanced methods in structural biology Chapter 14: Frontal gel filtration2014

    • 著者名/発表者名
      Ishida, T.
    • 総ページ数
      12
    • 出版者
      Springer Japan

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公開日: 2015-05-28  

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