| 研究課題/領域番号 |
25460689
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
古元 礼子 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (70311818)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | タンパクチップ |
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| 研究概要 |
１．遺伝子改変マウスを用いたタグ付抗体の作製
タグ付抗体産生マウスを抗原タンパク質（緑色蛍光蛋白質：EGFP）で免疫し、ハイブリドーマを樹立した。得られたハイブリドーマの培養上清を用いてELISAを行い、目的の抗原を認識するものをスクリーニングした。選択したハイブリドーマの培養上清を一次抗体に用いてウェスタンブロッティングを行い、抗原認識能の高いクローンを選択した。選択したハイブリドーマを限界希釈により単クローン化した。単クローン化したハイブリドーマを培養し、タグ付抗体を得ようとしたところ、タグ付抗体産生マウスから得られたハイブリドーマ（膜型IgG1クラス）は細胞増殖能が低く、長期間培養することができず、実験に十分な細胞の量が得られなかった。タグ付抗体産生マウスから得られた別のサブクラスのハイブリドーマ（IgG2a とIgG2b、タグなし）は細胞増殖能が高く、長期間培養が可能だったので、遺伝子改変操作でマウスの抗体遺伝子にタグを付けること自体が細胞に何らかの影響を与える可能性が示唆された。今後、分泌型遺伝子改変を行うか、あるいはゲノム編集等別の方法で抗体にタグを付加することを試みる必要がある。
２．タグ付モノクローナル抗体のマレイミド基板への固定条件の検討
培養細胞発現系で作製したタグ付モノクローナル抗体をマレイミド基板へ固定し、蛍光抗体法で固定状態を確認した。タグの無い抗体もマレイミド基板に固定された。抗体分子に含まれるシステインを介して基板に固定されると考えられた。基板に固定するためには抗体分子からタグ以外のシステインをできるだけ除去する処理を行ったほうが良いと考えられ、これは今後の検討課題である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究の目的を達成するための課題を検証し、当初の予定どおりでない部分もあるが、それに対処するための新たな検討課題が見つかっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
タグの無い抗体もマレイミド基板に固定された。抗体分子に含まれるシステインを介して基板に固定されると考えられた。基板に固定するためには抗体分子からタグ以外のシステインをできるだけ除去する処理を行ったほうが良いと考えられる。よって、まず、抗体（免疫グロブリン）の４量体を消化酵素処理によりFc領域を外したFabとF(ab’)2を作製し、基板への固定状態を検討する。次に遺伝子をクローニングし、軽鎖の末端にタグを付加した発現ベクターを作製し、培養細胞発現系あるいは大腸菌発現系でタグ付FabとF(ab’)2を作製し、基板に固定する。
また、タグ付抗体の大量生産のためには、分泌型遺伝子改変を行うか、あるいはゲノム編集等別の方法で抗体にタグを付加することを試みる必要がある。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度に行った実験の多くは手持ちの試薬類で対応できたので、大量の試薬購入に至らなかった。また、実験を進めるうえで、計画に見直しが必要となり、当初予定していた実験の一部を平成２６年度に行うこととなったため、これに伴う試薬等の購入について未使用額が生じた。
１．タグ付抗体大量作製方法の検討：培養細胞発現系の大量発現システム（Epi293 Expression system）によるタグ付抗体の作製、ゲノム編集によるハイブリドーマ産生抗体へのタグの付加を検討するための試薬の購入に使用する。
２．抗体（免疫グロブリン）を消化酵素で処理し、FabとF(ab’)2を作製し、wholeの抗体と小分子の抗体のどちらが基板の固定に適しているか検討するための試薬の購入に使用する。
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