| 研究課題/領域番号 |
25460699
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
佐藤 恵理子 順天堂大学, 医学部, 准教授 (60398675)
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| 研究分担者 |
小松 則夫 順天堂大学, 医学部, 教授 (50186798)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 慢性骨髄性白血病 / 病態モニタリング技術 / BCR/ABL融合点 |
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| 研究概要 |
本研究課題では，ゲノムDNAからBCR配列をもつDNA断片のみを濃縮し，これを次世代シークエンサーによって網羅的に解析することで，従来の手法では不可能であったCMLの再発を予測可能なレベルまでBCR/ABL遺伝子量を定量可能な，新規モニタリング技術を開発することを目的とする。25年度はゲノムDNAからBCRの配列をもつDNA断片を特異的に濃縮する技術を確立することを目標とし，検討を行った。
まず，CML由来の細胞株（K562, TCC-S, KCL-22）よりゲノムDNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型とし，BCR遺伝子のM-bcr領域（BCRエクソン12から15，およそ5 kbp）をPCRにより増幅した。電気泳動により目的のサイズにバンドがあることを確認した後，これを切り出して精製し，BCR配列濃縮用のプローブを作製するため，エンドヌクレアーゼによる酵素処理によってPCR産物を100～300 bpに断片化するための条件の最適化を行った。その後，決定された条件のもと，BCR配列を持つDNA断片を大量に獲得し，3'末端をビオチン化することで濃縮用プローブを作製した。
続いて，上記の3株の細胞ペレットを15%ホルマリンにて固定化し，パラフィン包埋法にてセルブロック化した。作製したブロックよりミクロトームを用いて薄片を切り出した。このとき，薄片の枚数，厚みを様々に変化させ，プローブに供試するに十分な量のゲノムDNAが得られる枚数・厚みを決定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
25年度はゲノムDNAからBCRの配列をもつDNA断片を特異的に濃縮する技術を確立することを目標とした。本年度においてプローブの作製とパラフィン包埋サンプルからのゲノムDNAの抽出法を確定させることはできたが，プローブとゲノムDNAのハイブリダイズとそれに続く溶出の条件最適化には至らず，次年度へ検討を持ち越すこととなってしまった。しかしながら，この遅延は微々たるものであり，次年度にて取り返せるものと判断し，「（3）やや遅れている」との評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
25年度において，細胞株（K562, KCL-22, TCC-S）のパラフィン包埋サンプルからのDNA抽出法の最適化，プローブ作製に関する最適化を終えたので，26年度において，プローブにより回収されたDNAが, BCRの配列を持つもののみであることを確認するため, 以下の要領によりPCRによる増幅を試みる。
これまでの検討により，K562, KCL-22, TCC-S株のBCR/ABL breakpointは明らかとなっている。そこで，回収されたDNAを鋳型として，BCR/ABL融合点近傍をPCRにより増幅できるか確認する。また，9番，22番いずれの染色体上にも存在しないRNasePをネガティブコントロールとし，これが回収されたDNAからは増幅されないことを確認する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
25年度の実験進捗の遅延のため，差額が発生してしまった。しかしながら，この遅延は次年度にて修正できるレベルであるため，差額を次年度への繰り越しとした。
当初の計画通り，プローブとゲノムDNAとのハイブリダイズ条件，およびプローブと結合したゲノムDNAの溶出条件の最適化のため，繰越金を使用する。その他の予算についても，計画通りに使用する。
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