| 研究課題/領域番号 |
25460705
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
井平 勝 藤田保健衛生大学, 医療科学部, 教授 (10290165)
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| 研究分担者 |
榎本 喜彦 藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (00387713)
杉山 博子 藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10387714)
吉川 哲史 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (80288472)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | HHV-6 / real-time PCR / cycling probe |
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| 研究概要 |
我々が、開発したLAMP法による標的遺伝子の迅速検出法は定量的評価、複数の遺伝子を単一反応で増幅するmultiplex化という観点ではいまだ課題が多い。この問題点を解決するに当たり、本研究ではLAMP法とcycling probeを融合し問題解決を図る。最初に、HHV-6LAMP反応液中に標的遺伝子、cycling probeとRNase H を加え、real-time PCR機により蛍光強度を連続測定した。しかし、アガロースゲル電気泳動では標的遺伝子増幅が確認できるにもかかわらず cycling probeの切断による蛍光強度の上昇が観察されずRNase Hの活性が十分ではないと考えられた。そこで本年は、LAMP反応ではなく、まずPCR反応において確実に標的遺伝子増幅並びに検出が可能な測定系の構築を目指した。HHV-6AとHHV-6BのU31遺伝子内のSNPsを含む領域にそれぞれ異なった蛍光色素で標識した2種類のcycling probeを設計した。標的領域をサブクローニングしてreal-time PCRのキャリブレーション曲線を作成した。Singleplex反応（単一標的遺伝子検出）では、HHV-6A、HHV-6B共に10～1,000,000 copies/反応の範囲で検出が可能だった。定量性の観点からは、HHV-6Aでy=-1.42ln(x)+43.7 R2=0.999、HHV-6Bでもy=-1.44ln(x)+43.9 R2=0.999と優れた直線性を示した。同一チューブ内に両方の標的遺伝子が存在するようなMultiplex反応系では、直線性は優れていたものの測定範囲は100～1,000,000copies/反応であった。今回作成したCycling probe法によるHHV-6A、Bのreal-time PCR法は、非常に特異性が高く高感度で、再現性もすぐれていた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Cycling probe とPCR法を組み合わせたHHV-6AとHHV-6B遺伝子定量法を作成するという点で、今年度の研究は順調に進んだ。今後、臨床検体を測定しその有用性について検討を行い、最終的にはHHV-6AとBを区別すするような臨床研究において、今回の方法を標準的な検出法として利用する予定である。初年度に問題となったLAMP反応におけるRNase活性の問題について、計画段階ではcycling probe切断による標的遺伝子（LAMP増幅産物）の目視識別は、probeを分解するRNaseの反応至適温度がLAMP 法のBst ポリメラーゼの反応温度とほぼ等しいことから都合がよいと予想していた。しかし、アガロースゲル電気泳動では標的遺伝子増幅が確認できるにもかかわらず蛍光強度が上昇しないことから、LAMP反応中のRNase H活性が不十分であると考えられた。今後、LAMP反応中でRNase H活性を維持するための基礎的検討が必要となる。また近年報告された新たな DARQ probe (Tanner N.A. et al BioTechniques 53:81-89 2012) もLAMP法に利用可能であることが示されており、cycling probe からこのような新規プローブへの変更も検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、まずLAMP反応中にもRNaseHが十分な活性を持つようにbufferについての至適条件を検討する。条件設定が困難であれば、DARQ probe による検出も考慮する。LAMP反応と最適な検出用probeの条件設定が完了した後、HHV-6LAMP法の試薬を乾燥化するための基礎検討を行い、乾燥試薬でも液状試薬と同じ感度を得られることを確認する。Probeに標識する蛍光色素としては、肉眼で識別が可能なようにハンディライトの励起光により異なる発色を示す緑色蛍光(FAM)色素と赤色蛍光(ROX)色素を用いる予定である。乾燥試薬の至適条件設定後、cycling probeまたはDARQ probe をLAMP反応液に添加、probeの添加が検出感度に影響しないことを確認する。その後本検査法の再現性を評価するため、異なった検査者による目視での判定でも安定した結果が出ることを確認する。臨床応用する上で十分な感度を決定した後は、特異性を確認するため8 種類のヒトヘルペスウイルスDNA を用いて交差反応性がないかも検討する。
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