サイクリングプローブLAMP法によるHHV-6型特異的定性/定量検出法の開発

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25460705
• 研究機関: 藤田保健衛生大学
• 研究代表者: 井平 勝 藤田保健衛生大学, 保健学研究科, 教授 (10290165)
• 研究分担者: 榎本 喜彦 藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (00387713) ; 杉山 博子 藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10387714) ; 吉川 哲史 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (80288472)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: HHV-6A / HHV-6B / cycling probe / LAMP

研究実績の概要

最初に HHV-6U31領域についてHHV-6A、Bの共通遺伝子配列部分にLAMP primerを設計した。HHV-6A,Bの配列中にはHHV-6AとBを識別可能なSNPが配置されるようにそれぞれのcycling probeを設計した(異なった蛍光色素を使用）。LAMP primerの性能を評価するためLAMP試薬とprimer（2.4μM FIP,BIP, 1.2μM LPB,0.6μM F3,B3,0.2μM）8U Bst polymeraseで評価した（LPFはprobeとして使用のため加えない）。濁度決定によるこのLAMP法の感度は、HHV-6A,Bの両ウイルスDNAにおいて反応あたり100コピーであった。
cycling probe LAMP法至適条件としてpHの検討を行った。LAMP bufferのpHを8.8と7.5とした2種類を用意し標的領域を含むDNAを加えCt(cycle of thresdhold)値を比較した。蛍光強度はpH7.0よりもpH8.8のbufferの方が速く蛍光強度が増していた。次に、probe濃度（200n M、400n M）についてを検討した。LAMP bufferとHHV-6 primer,2.4μM FIP,BIP, 1.2μM LPB, 0.6μM F3,B3,0.2μM H6B cycling probe、RNaseH 0.5μl、HHV-6B plasmid 5μl（107-109copies/反応）で全量25μlとした。Ct値とコピー数の相関（200ｎM:r2=0.87、400nMr2=0.98）はprobe濃度を400nMにした方が優れており1000-1000000コピー/反応で優れた直線性が確認された。LAMP法とcycling probeの組み合わせによってLAMP反応による遺伝子増幅をcycling probeで検出できることが明らかとなった。現在の検出感度としては103コピー/反応とreal-timePCRと比較して十分であるとは言えず感度上昇の工夫が必要である。簡易な感度上昇手段として熱変性があるがBst polymeraseが80℃で失活してしまうことから現実的でないためアルカリ変性など他の感度上昇手段を講じる必要がある。

研究成果

• [雑誌論文] A simple cytogenetic method to detect chromosomally integrated human herpesvirus-6. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ohye T, Kawamura Y, Inagaki H, Yoshikawa A, Ihira M, Yoshikawa T, Kurahashi H.
  • 雑誌名: J Virol Methods. 巻: 228: ページ: 74-8
  • DOI: 10.1016/j.jviromet.2015.11.001.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cycling probe-based real-time PCR for the detection of human herpesvirus 6A and B. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ihira M, Yamaki A, Kato Y, Higashimoto Y, Kawamura Y, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: J Med Virol. 巻: Epub ahead of print ページ: 000
  • DOI: 10.1002/jmv.24513.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Pathogenic Role of Human Herpesvirus 6B Infection in Mesial Temporal Lobe Epilepsy. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kawamura Y, Nakayama A, Kato T, Miura H, Ishihara N, Ihira M, Takahashi Y, Matsuda K, Yoshikawa T
  • 雑誌名: J Infect Dis. 巻: 212(7) ページ: 1014-21.
  • DOI: 10.1093/infdis/jiv160.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pathogenesis of Severe Neutropenia in Patients With Primary Human Herpesvirus 6B Infection. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Kawamura Y, Ozeki E, Ihira M, Ohashi M, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: Pediatr Infect Dis J. 巻: 34(9) ページ: 1003-7
  • DOI: 10.1097/INF.0000000000000777.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Virological analysis of inherited chromosomally integrated human herpesvirus-6 in three hematopoietic stem cell transplant patients. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Kawamura Y, Kudo K, Ihira M, Ohye T, Kurahashi H, Kawashima N, Miyamura K, Yoshida N, Kato K, Takahashi Y, Kojima S, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: Transpl Infect Dis. 巻: 17(5) ページ: 728-31.
  • DOI: 10.1111/tid.12419.
  • 査読あり
• [学会発表] Development of HHV-6A Real-Time RT-PCR Assays for Detection ofThree Classes of HHV-6A Gene Transcripts (2015)
  • 著者名/発表者名: Masaru Ihira, Hiroki Miura, Yuki Higashimoto, Fumihiko Hattori, Yoshiki Kawamura, Ken Sugata, Tetsushi Yoshikaw
  • 学会等名: 9th international conference on HHV-6,7
  • 発表場所: Boston MA,USA
  • 年月日: 2015-11-09 – 2015-11-11
  • 国際学会
• [学会発表] Human Herpesvirus 6B Infection in Pediatric Hematopoietic Stem Cell Transplantation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Miura1, Yoshiki Kawamura, Fumihiko Hattori1, Kazuko Kudo, Masaru Ihira, Tetsushi Yoshikawa
  • 学会等名: 9th international conference on HHV-6,7
  • 発表場所: Boston MA,USA
  • 年月日: 2015-11-09 – 2015-11-11
  • 国際学会
• [学会発表] The Analysis of the Origin of Chromosomally Integrated Human Herpesvirus 6 (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Kawamura1, Tamae Ohye2, Hiroki Miura, Masaru Ihira, Hiroki Kurahashi, Tetsushi Yoshikawa
  • 学会等名: 9th international conference on HHV-6,7
  • 発表場所: Boston MA,USA
  • 年月日: 2015-11-09 – 2015-11-11
  • 国際学会
• [学会発表] Real-time RT PCR法によるHHV-6AmRNA検出法の構築 (2015)
  • 著者名/発表者名: 井平 勝、東本 祐紀 、加藤友理、平松裕之、鈴木竜太、三浦浩樹、河村吉紀、吉川 哲史
  • 学会等名: 第56回日本臨床ウイルス学会
  • 発表場所: 日本 岡山
  • 年月日: 2015-06-13 – 2015-06-14