蛍光共鳴エネルギー移動を利用した迅速かつ簡便なテロメラーゼ活性測定法の開発

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25460708
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 甲南大学
• 研究代表者: 村嶋 貴之 甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 教授 (20263923)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: テロメラーゼ / 蛍光共鳴エネルギー移動 / ガン診断 / TRAP assay / G-quadruplex

研究概要

テロメア鎖の相補鎖である12merのオリゴヌクレオチド（CCCTAACCCTAA）の５’末端側に蛍光色素（FAM）を結合させた化合物をプローブとして用いることで、サンプル中のテロメア鎖の総量を測定することができた。実際の手法は、モデルとして種々の長さのテロメア鎖を任意の濃度で混合した溶液（モデル試料）やHeLa細胞からの抽出液（実試料）について、含まれる酵素の失活などの必要な処理の後、プローブ溶液とインターカレ―ターとしてのエチジウムブロミド（EB）を混合し、蛍光を測定するという極めて簡単な手法である。この手法の原理は、テロメア鎖と二重鎖を形成したプローブについては、FAMとEB間のFRETにより消光が起こるのに対し、溶液中にフリーで丼剤するプローブはFRETを起こさないことから、蛍光消光率が大きいほど、テロメアの総量が多いことになる、というものである。
モデル試料では、48merのテロメア鎖に換算して1.2 nMまで検出可能であり、HeLa細胞抽出液を用いた場合には、400 cells以上であれば有意にテロメラーゼ活性を測定することが可能であった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究目的に記載したモデル試料を用いた手法の最適化、および実試料を用いたテロメラーゼ活性を指標とする「癌細胞と正常細胞の識別」について、ほぼ当初の目的を達成しており、こうした研究結果をOrg. Biomol. Chem., 2014, 12, pp. 936-941.にまとめることができた。また、本研究に関連して、J. Phys. Chem. B, 2014, 118, pp. 2605-2614. Methods, 2013, 64, pp. 19-27. Molecules, 2013, 18, pp. 11751-11767. Biochemistry, 2013, 52, pp. 5620-5628. などの報告を行っている。

今後の研究の推進方策

本研究においてこれまで開発してきた手法は、テロメラーゼ活性が高い程蛍光が消光される、という、いわばシグナルOFF型のガン診断手法である。したがって、その原理からバックグラウンド蛍光などによる感度の低下が懸念されるため、「テロメア鎖の総量が多い程蛍光強度が強くなる」、すなわちシグナルON型のセンシングへと発展させることが望まれる。そのため、今後の研究推進の方向と方策については、これまでに用いたものとは発光原理の異なる蛍光色素を開発し、それらを用いたテロメラーゼの活性測定法の開発について検討する。
現在のところ、もちいる蛍光色素の発光原理として、凝集誘起発光特性を有する色素の利用を検討している。
また、ガン細胞中のテロメア鎖を検出することでガンの診断を行う、というコンセプトは、「ガンという疾病において特徴的に増加する物質をセンシングする」ということであり、同様の関係はアルツハイマー病とAβの間にも成立するため、同じような考え方でAβのセンシングに利用可能なセンシングシステムの開発についてもチャレンジする。

次年度の研究費の使用計画

研究の進展にあわせて平成25年度に備品（サーマルサイクラー）を購入の予定であったが、研究が当初予想したものとは少し異なる方向に進展したため、別の検討を行った。その結果、サーマルサイクラーは平成26年度購入の予定となった。
申請時の計画のうち、一般消耗品等については計画通り使用する。平成25年度の未使用額はおもに備品であり、購入が平成26年度にずれ込んだので、平成26年度に購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] A simple “add and measure” FRET-based telomeric tandem repeat sequence detection and telomerase assay method (2014)
  • 著者名/発表者名: Koji Kawamura,Hidenobu Yaku, Daisuke Miyoshi, Takashi Murashima
  • 雑誌名: Organic & Biomolecular Chemistry 巻: 12 ページ: 936-941
  • DOI: 10.1039/c3ob42092b
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vitro assays predictive of telomerase inhibitory effect of G-quadruplex ligands in cell nuclei (2014)
  • 著者名/発表者名: Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Daisuke Miyoshi, Naoki Sugimoto
  • 雑誌名: Journal of Physical Chemistry B 巻: 118 ページ: 2605-2614
  • DOI: 10.1021/jp410669t
  • 査読あり
• [雑誌論文] Study on effects of molecular crowding on G-quadruplex-ligand binding and ligand-mediated telomerase inhibition (2013)
  • 著者名/発表者名: Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Hisae Tateishi-Karimata, Shuichi Nakano, Daisuke Miyoshi, Naoki Sugimoto
  • 雑誌名: Methods 巻: 64 ページ: 19-27
  • DOI: 10.1016/j.ymeth.2013.03.028
  • 査読あり
• [雑誌論文] A highly sensitive telomerase activity assay that eliminates false-negative results caused by PCR inhibitors (2013)
  • 著者名/発表者名: Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Daisuke Miyoshi, Naoki Sugimoto
  • 雑誌名: Molecules 巻: 18 ページ: 11751-11767
  • DOI: 10.3390/molecules181011751
  • 査読あり
• [雑誌論文] Multiple and cooperative binding of fluorescence light-up probe thioflavin t with human telomere DNA G-quadruplex (2013)
  • 著者名/発表者名: Valérie Gabélica, Ryuichi Maeda, Takeshi Fujimoto, Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Naoki Sugimoto, Daisuke Miyosh
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 52 ページ: 5620-5628
  • DOI: 10.1021/bi4006072
  • 査読あり
• [学会発表] 凝集誘起発光 (AIE) 特性および光誘起電子移動 (PeT) 特性を有する蛍光色素の合成と物性評価
  • 著者名/発表者名: 河村 浩司・池田 創・加賀山 弘樹・村嶋 貴之
  • 学会等名: 日本化学会第94春季年会
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] 両親媒性ポルフィリンを用いたカプセル型超分子の作製
  • 著者名/発表者名: 北 拓朗・村嶋 貴之
  • 学会等名: 日本化学会第94春季年会
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] 生理的pHで蛍光ON/OFFの制御可能なBODIPY誘導体の合成
  • 著者名/発表者名: 池田 創・河村 浩司・村嶋 貴之
  • 学会等名: 日本化学会第94春季年会
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] ポルフィリンDNAコンジュゲートによる超分子構造の構築
  • 著者名/発表者名: 河村 尚登・村嶋 貴之
  • 学会等名: 日本化学会第94春季年会
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] DNAとポルフィリンから構成された機能性分子の合成
  • 著者名/発表者名: 石田 隆真・河村 浩司・村嶋 貴之
  • 学会等名: 日本化学会第94春季年会
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] 生命分子の挙動に及ぼす分子環境の効果（56）アニオン性フタロシアニンによるがん細胞特異的増殖阻害
  • 著者名/発表者名: 夜久 英信・村嶋 貴之・三好 大輔・杉本 直己
  • 学会等名: 日本化学会第94春季年会
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] FRET-based detection of G-quadruplexes in the 5'-UTR of cancer related mRNAs
  • 著者名/発表者名: Ryuichi Maeda, Valerie Gabelica, Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Naoki Sugimoto, Daisuke Miyoshi
  • 学会等名: The 40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry,
  • 発表場所: Kanagawa University
• [学会発表] G-quadruplex-based drug delivery carrier in response to target mRNA
  • 著者名/発表者名: Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Daisuke Miyoshi, Naoki Sugimoto
  • 学会等名: The 40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: Kanagawa University
• [学会発表] FRETを利用したmRNA四重らせん構造の特異的検出
  • 著者名/発表者名: 前田 龍一・Gabelica Valerie・夜久 英信・村嶋貴之・杉本 直己・三好 大輔
  • 学会等名: 第7回バイオ関連化学シンポジウム
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] G-quadruplexを利用した標的mRNA応答型ドラッグデリバリーシステムの開発
  • 著者名/発表者名: 夜久 英信・村嶋 貴之・三好 大輔・杉本 直己
  • 学会等名: 第7回バイオ関連化学シンポジウム
  • 発表場所: 名古屋大学
• [学会発表] Molecular Crowding Effects on Functions of G-Quadruplex Ligands
  • 著者名/発表者名: Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Hisae Tateishi-Karimata, Shu-ichi Nakano, Naoki Sugimoto, Daisuke Miyoshi
  • 学会等名: 4th International Meeting on G-quadruplex Nucleic Acids
  • 発表場所: Nanyang Technological University, Singapore
• [学会発表] Biomolecule-Ligand Noncovalent Complexes: Mass Spectrometry as a Key to Interpret Solution Fluorescence Data
  • 著者名/発表者名: Daisuke Miyoshi, Ryuichi Maeda, Takeshi Fujimot, Hidenobu Yaku, Takashi Murashima, Naoki Sugimoto, Adrien Marchand, Frederic Rosu, Valerie Gabelica
  • 学会等名: 61st ASMS (American Society for Mass Spectrometry) Conference
  • 発表場所: Minneapolis, Minnesota