| 研究課題/領域番号 |
25460871
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
柿崎 英二 宮崎大学, 医学部, 准教授 (70284833)
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| 研究分担者 |
湯川 修弘 宮崎大学, 医学部, 教授 (30240154)
酒井 正博 宮崎大学, 農学部, 教授 (20178536)
小澤 周二 三重大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20379944) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 法医学 / 溺死 / 水棲微生物 / Aeromonas属 / LAMP法 |
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| 研究実績の概要 |
これまでの我々の研究成果から，Aeromonas属細菌は，淡水溺死の指標として特に効果的であることが明らかになっている。そこで，細菌の種レベルでの識別に有効なgyrase subunit B遺伝子に着目し，日本DNAデータバンク(DDBJ)からAeromonas属細菌及びその他の細菌について塩基配列情報を収集した．次いで，収集した配列に対してGENETYX-MACを用いてアライメント解析を行い，Aeromonas属細菌を特異的に検出可能なプライマーセット（属特異的プライマー）を設計した．次いで，そのプライマーセットを用いて至適条件を検討した結果，反応温度63℃，反応時間80 minの条件下で最も検出感度が高く, ゲノムDNA濃度10 pg/tube（NBRC標準菌株：A. hydrophila, A. salmonicida）まで検出可能であった．さらに，このプライマーセットの特異性を調べるために，NBRC標準菌株9属15種（Vibrio属3種，Photobacterium属3種， Escherichia属1種，Listonella属1種，Pseudomonas属2種，Citrobacter属1種，Enterococcus属1種，Proteus属1種，Shewanella属2種），及びその他の細菌種143株（Aeromonas属14株，Bacillus属6株，Enterobacter属3株，Halomonas属2株，Lactococcus属2株，Marionomas属1株，Pantoea属3株，Pseudoalteromonas属5株，Psychrobacter属6株，Serratia属2株，Staphyrococcus属5株，Vibrio属26株など）に対して，LAMP法を試みたところ，Aeromonas属14株（A. allosaccharophila, A. hydrophila, A. molluscorum, A. popoffii, A. punctata, A. salmonicida, A. veronii, A. spp.）に対してのみ陽性を示し，本法の優れた特異性が示された．今後，法医解剖例（溺死例及び非溺死例）における肺及び血液試料に対して，LAMP法を試み，新しい簡易迅速検査法として実務利用が可能か否かを検討する．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は，簡便かつ迅速な溺死のスクリーニング検査法（淡水溺死）を開発することであり，平成26年度までの研究結果からAeromonas属細菌を特異的に検出可能な4つのプライマーセット（F3,18 mer; FIP,40 mer; BIP,41 mer; B3,17 mer）を設計し，計143株の細菌に対して特異性を調査した．その結果，我々の設計した4つのプライマーセットは，Aeromonas属細菌に対して極めて優れた特異性（属特異性）を有することが明らかとなり，淡水溺死を診断する上で優れた検査法と成り得る可能性が示された．また検出感度はNBRC標準菌株（A. hydrophila, A. salmonicida）に対して10 pg/tubeであり，十分な検出感度が得られた．さらに本法は，試薬の準備や調整が非常に簡単であり，反応温度も63℃の一定温度で行うことができ，反応時間も僅か80 minで終了するため，極めて簡便かつ迅速な検査法であることが示された．最終年度（平成27年度）において実施予定である法医実務の応用に向けて，準備が整った．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後（平成27年度）は，実際の解剖例（溺死例及び非溺死例）計50例程度に対して，それらの肺（右肺下葉内部，左肺上葉辺縁部）及び血液（左心血，右心血，大腿静脈血）を検査試料としてLAMP法を試み，新しい簡易迅速診断法として実務利用が可能か否かを最終的に評価する．また，3月までにこれらの研究結果を論文にまとめ，法医学関連の国際誌に投稿し世界に先駆けてその成果を発信したい．また，国際学会等にも積極的に参加し，広く公表したい．
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