| 研究課題/領域番号 |
25460957
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
谷田 諭史 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30528782)
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| 研究分担者 |
城 卓志 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30231369)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | Annexin A2 / TNF-alfa / ADAM17 / 炎症性腸疾患 |
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| 研究概要 |
低分子で安価な新しい抗TNF-α治療の確立を目指し、ANX A2阻害薬スクリーニング系を完成させ、候補薬剤を同定する。この目標を達成するために、まず、ANX repeat I-IVとADAM17結合部位と考えられる cysteine-rich domain (CR)およびdisintegrin domain (D)結合部位をGST pull-down assayで確認した。i)FLAG標識ANX A2 I-IV（4つの結合候補部位）発現ベクター (Mol Biol Cell. 1964-75, 2012)、ii)GST結合ADAM17細胞外ドメインGST-CRおよびGST-D蛋白。今回は、全長を網羅する4つの結合候補部位、FLAG標識ANX A2 I-IV遺伝子発現ベクターを単球細胞株（U937,THP-1,P31）および大腸上皮細胞株（HT29, HCT116）に強発現し、細胞溶解後、GST-CRおよびGST-D蛋白と混合し、抗FLAG抗体を使って免疫沈降後、ウェスタン解析を行い、ANX repeat I-IVとADAM17の結合部位を確認し、結合部位を確認した。４つ結合候補部位の蛋白を、それぞれDonor beadsとAcceptor beadsに付替えた４つの検出系を調整している。また、候補薬剤を探索するための約9000種類の低分子リード化合物 から、ANX A2とCRの結合を抑制する候補薬剤をAlphaScreen systemを使用し探索中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
約9000種類の低分子リード化合物から、ANX A2とCRの結合を抑制する候補薬剤をAlphaScreen systemを使用し探索中であり、候補化合物を特定するのに時間を要する。また、ANX A2蛋白の炎症性腸疾患における炎症惹起および増悪への役割を検討するため、ANX A2-/-マウス作製中である。現在、ANX A2ヘテロ＋/-マウスは、作製されているが、ヘテロマウスの妊孕性の問題でノックアウトマウス樹立に時間がかかっている。ヘテロマウスを繰り返し作製し妊孕性の高い系のノックアウトマウス樹立を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きAlphaScreen systemを使用し候補化合物を特定していく。ANX A2蛋白の炎症性腸疾患における炎症惹起および増悪への役割を検討するため、ANX A2-/-マウスDSS腸炎（潰瘍性大腸炎）モデルでの、候補低分子化合物の抗炎症効果の解析を行う。現在、ANX A2ヘテロ＋-マウスは、作成されており、ノックアウトマウス作製中である。ANX A2-/-マウスが完成すれば、DSS腸炎（潰瘍性大腸炎）モデルでの炎症の抑制の可否を野生型マウスと比較検討する。また、候補薬剤が得られれば、候補薬剤が腸炎モデルで、抗炎症効果を発揮するかどうかの検討を行っていく。また、T細胞移入腸炎惹起（クローン病）モデルの実験を行うため、ANX A2－Rag2ダブルノックアウトマウス作製を行っていく。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
候補薬剤スクリーニングに時間がかかっており、スクリーニングに使用する予算が残っている。また、ANX A2-/-マウス作製中である。現在、ANX A2ヘテロ＋/-マウスは、作製されているが、ヘテロマウスの妊孕性の問題でノックアウトマウス樹立に時間がかかっている。ヘテロマウスを繰り返し作製し妊孕性の高い系のノックアウトマウス樹立を行っている状態。ANX A2－Rag2ダブルノックアウトマウス作製のための予算として差額が生じている。
候補薬剤スクリーニング予算およびANX A2-/-マウス樹立完成後、引き続いてANX A2－Rag2ダブルノックアウトマウス作製のための予算として使用する。
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