| 研究課題/領域番号 |
25460991
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
高橋 健 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60594372)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ウイルス肝炎 / 免疫学 |
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| 研究概要 |
HBV駆除のための効果的な治療法の開発にはHBVに対する宿主免疫応答の十分な理解が必須といえる。B型肝炎の免疫研究には小動物モデルを用いたHBVに対する免疫応答の解析が有用と考えられるが、HBVはマウス肝細胞に感染しないため、従来のHBV研究分野におけるマウスの利用は、主にHBV トランスジェニックマウスに限定されていた。重要なことは、従来のモデルは肝炎を自然発症するモデルではない点であり、B型肝炎の免疫学的解析には本質的に不向きであったといえる。そこで、本研究においては、1.ウイルス抗原(HBs抗原)を肝特異的に任意の時期に発現させることにより肝炎を自然発症する新たなHBVモデルマウスを構築し、2.このモデルマウスを用いてB型肝炎での宿主免疫応答を明らかにすることを目標に掲げた。本研究では、宿主免疫応答の解析ツールとして、次世代シークエンスによるトランスクリプトーム解析(RNA-seq)を用いることを特徴とする。今年度の研究成果の概要として、1.B型肝炎自然発症モデルマウス作成に関しては、HBs抗原をCre存在下に発現するHBs抗原コンディショナルトランスジェニックマウスを作成した。また、タモキシフェン投与により任意の時期に肝臓特異的にCreを発現するAlb-Cre-ERT2マウスを準備し、タモキシフェン投与による肝臓でのCre発現を確認した。2.次世代シーケンサーを用いたRNA-seq解析に関しては、新たな実験手法であり、Pilot studyによる実験系の立ち上げを試みた。健常人末梢血単核細胞を採取後、in vitro実験でのサイトカイン刺激を行いRNA-seqを行った。その結果、多くの既知、或いは未知のサイトカイン誘導遺伝子が検出され、RNA-seqの実験系が確立された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1.B型肝炎自然発症モデルマウス作成：過去にHBVトランスジェニックマウス作成に使用されたHBVのfunctional clone (AYW1.3) のプラスミドの供与を海外研究室より受け、それをもとにHBs抗原をCre存在下に発現するHBs抗原発現ベクターを作成し、HBs抗原発現マウスを作成した。一方で、アルブミンプロモーター下にCre組換え酵素と変異型エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインとの融合タンパクであるCreERT2を発現するマウス、すなわち、タモキシフェン投与により任意の時期に肝臓特異的にCreを発現するAlb-Cre-ERT2マウスを準備し、タモキシフェン投与による肝臓でのCre発現を確認した。2.次世代シーケンサーを用いたRNA-seq解析に関しては、新たな実験手法であり、Pilot studyによる実験系の確立を試みた。健常人末梢血単核細胞を採取後、IFNa, IFNg, TNFaによるin vitro実験でのサイトカイン刺激を行いRNA-seqを行った。その結果、各サイトカインで誘導されることが報告されている既知のサイトカイン誘導遺伝子、或いは未知の遺伝子が検出されることが確認された。次に、実際のB型肝炎症例において増悪期から回復期に至る過程の血球細胞を採取し、RNA抽出のうえRNA-seqを行い、現在、臨床経過中における免疫関連遺伝子の変動に関する解析を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述のとおり、タモキシフェン投与により肝臓特異的にHBs抗原を発現するマウスを作成し、加えて、遺伝子発現プロファイル解析ツールとしてRNA-seqの実験系を確立した。今後は、タモキシフェン投与により肝炎惹起を試みたうえで肝炎発症後のマウス由来の免疫細胞を採取しRNA-seqを行い、HBV感染における宿主免疫応答の状態やその活性化機構を包括的に解明する。その第一段階として、HBs抗原発現の確認や発現の至適条件の検討を行う。また、本モデルマウスにおいてはタモキシフェン投与前にCre発現のleakがあるとHBs抗原に対して免疫寛容状態となり、免疫応答が弱く肝炎の程度も軽度となる可能性があり、この点に関して今後十分に評価検討する必要がある。なお、本研究では遺伝子改変マウスを用いるため、HBV感染肝細胞内で生じる自然免疫応答に関しては解析できない問題がある。この点を補完すべく、ヒト肝細胞置換キメラマウス由来HBV感染肝細胞を準備し、採取した肝細胞よりRNAを抽出しRNA-seq解析を行い、感染細胞内での自然免疫応答の評価を行うことも計画している。また、現在進行中のB型肝炎患者を対象としたRNA-seq解析に関しては、さらなる症例蓄積により今後も解析を継続していく予定である。
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