| 研究課題/領域番号 |
25461004
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
藤原 圭 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70635804)
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| 研究分担者 |
新海 登 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), その他 (30543988)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | B型肝炎ウイルス / RNA |
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| 研究概要 |
B型肝炎ウイルス(HBV)感染に伴う慢性肝疾患は現在のところ疾患の進行を抑制する治療は行われているが、根治的治療が確立されていない難治疾患である。我々は過去にHBVに関する研究を通じてHBV遺伝子変異、HBV複製メカニズム、およびその臨床的意義に精通しており、本研究では、過去に報告のないHBVが肝細胞内で複製および構造蛋白生成のために転写する異なる4種類のmRNAをリアルタイムPCR法により定量的に測定する新しい実験系を開発し、さらに潜在性HBV感染を含む臨床病態、ウイルス複製のメカニズムとの関連を検討する。加えて当mRNA定量系を用いることにより、各種肝細胞特異的転写因子や薬剤候補となりうる化合物が、HBV転写に与える影響を評価してゆく。当実験系を開発するに当たり、まずリアルタイムPCRを行うためのプライマーの設定を行い、その妥当性について遺伝子解析ソフトを用いて確認した。HBVは遺伝子配列における変異が高頻度であり、各遺伝子型間の遺伝子配列も大きく、いずれのウイルスの遺伝子配列にも相同性のあるリアルタイムPCRを行うためのプライマーおよびタックマンプローブの同時設定が難しく、かつとても重要である。核酸抽出方法についても、RNA、DNAを肝組織、血液から行う上で効率性、作業性からよいと思われる核酸抽出方法を選択した。今後さらに実際のリアルタイムPCR測定を開始し、系の安定性や一期的な測定が可能かどうかをPCRの温度設定を行いながら確認してゆく。またRNA、DNAの混在による影響の確認に関して各核酸分解酵素を用いた定量により行う。安定した測定系の確立後に、実際の臨床検体を用いて各RNAの測定を行い臨床情報、HBV DNA量、コアプロモーター変異といったウイルス情報、ウイルス蛋白の検査データと併せて解析し、病態の進行、薬剤感受性、発癌リスクとの関連を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HBV mRNAを定量する上でまず行わなければならないのは、プライマーの設定である。HBVは遺伝子配列における変異が高頻度であり、各遺伝子型間の遺伝子相違も大きく、いずれのウイルスの遺伝子配列にも相同性のあるリアルタイムPCRを行うためのプライマーおよびタックマンプローブの同時設定が難しく、かつとても重要である。それを解析し、プライマー、プローブの設定を行い、その安定性や妥当性について、遺伝子解析ソフトを用いて行った。各領域のmRNAに対するリアルタイムPCRが一期的に可能か、PCRの温度設定上、各別々に行う必要があるか等の検討項目が多数あり、一つ一つを検討していった。次に、今回ウイルス遺伝子抽出を行う検体が、肝組織および血液となり、基本的にRNA抽出が主体であるものの、HBVの本来の遺伝子であるDNA抽出も必要となることから、各RNA、DNAごと、肝組織、血液から核酸抽出を行う上で、今回の対象がウイルス遺伝子である点も考慮し、最も効率性、作業性からよいと思われる核酸抽出方法を選択した。純度の高いRNA、DNAが得られること、検出段階で、リアルタイムPCR自体が、RNA、DNAを選択的に検出する方法をとっているものの、コンタミネーションによる影響を排除するため、RNA抽出における、DNA排除、逆にDNA抽出におけるRNA排除の点についても十分に検討し、プロトコールを作成している。さらに当実験系を確立するために必要な、マテリアルとしてHBVウイルス核酸を含む血液検体の採取や、肝組織の採取も同時に進めている。特に最近の報告ではHBV感染者の血液検体におけるHBV RNAの報告がみられ、感染者の状態により定量的なレベルが異なると思われるため、コンディションの異なる検体の採取が必要となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
実際の検体を用いた核酸抽出を進めていく。その上で、RNA定量における、DNA混入を避け、純粋にRNAだけを検出していることの確認および、定量作業が必要となる。各領域のmRNA定量を行う際に、プライマー、プローブのアニーリング温度設定についても、一期的な検出が実際可能かどうかについて、机上ではなく、実際の作業の中で確認する必要がある。今回確立する実験系は、各領域のmRNAの定量性の差が重要となるため、細部に渡る精度確認が必要となる。予備実験として温度設定や、核酸抽出方法や、RNAもしくはDNAの失活を行い、相互核酸の影響がないか、影響がある場合はどの程度かを逐一確認しながら実験をすすめる必要がある。検体のコンディションや被験者の臨床的状態の違いが測定系に与えうる影響についても予備実験で確認する必要がある。さらにmRNA定量値の患者臨床データとの比較検討を行う。構築された実験系を用いて、患者検体を使用し各領域のmRNA発現を検討する。mRNA定量測定を行い得られたデータとHBV感染慢性肝疾患患者臨床データを用いて慢性肝炎患者の病態、薬剤に対する感受性などと関連するmRNA定量値を解析し、各種mRNAの増減がどのように臨床像に影響を及ぼしているか詳細に調べ、バイオマーカーとしての可能性を検討する。得られたmRNAのデータをデータベース化した詳細な患者の臨床情報、HBV DNA量、プレコア、コアプロモーター変異といったウイルス情報、ウイルス蛋白の血清学的検査データと併せて解析し、病態の進行、薬剤感受性、発癌リスクとの関連を検討する。以上、リアルタイムPCRを行うための設定、核酸抽出方法の決定から、実際の定量系の測定を進めてゆく。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度に購入する物品費、旅費が計画より減額となったためです。
平成26年度の物品費、旅費として使用します。
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