研究課題
基盤研究(C)
末梢血単核球中の未分化血管内皮前駆細胞(Endothelial Progenitor Cell = EPC)の増幅・分化培養による評価系開発に成功した（特願第2012－218206号）。本培養系を用いて、末梢血単核球中CD34+細胞分画の未分化EPCの分化、増幅に対するCD34-細胞分画の細胞間クロストークにおいてNotchシグナルの関与を探索した。成果として、１）幹・前駆細胞の分化・増幅に関係するNotchシグナル抑制剤のγsecretase inhibitor添加した末梢血単核球の本培養においてEPC分化増幅能の抑制が認められ、Notchシグナル系が重要であることが判明した。２）次に、Jagged-1(Jag-1)またはDelta like-4(DLL4)の中和抗体を添加し末梢血単核球のQQ培養を実施した。Jag-1抗体はEPCの増幅よりも分化を抑制し、DLL4抗体は分化よりも増幅をそれぞれ抑制した。３）CD34-細胞分画の中で単球（CD14+細胞）、リンパ球（CD3+細胞）、その他の細胞(CD34-/CD3-/CD14-細胞)の各細胞群とCD34陽性細胞の共培養を行い、EPC分化、増幅における責任細胞群を同定した。結果、CD14+細胞との共培養系においてCD34+細胞の機能性EPCコロニーが著増した。この結果は、EPCの分化・増幅能においてCD34細胞とCD14細胞との細胞間クロストークが存在することを意味する。以上の結果から、CD34+細胞のEPC増幅、分化において単球系の貢献が重要であり、その機構としてCD34+細胞のNotchリセプター及び単球系のJag-1やDLL4リガンドの発現が想定される。次年度以降は、CD34+細胞のEPC増幅・分化におけるCD34+細胞と単球系のNotchシグナルの重要性を検証する。
2: おおむね順調に進展している
１） EPC (CD34+細胞)の分化・増幅におけるCD34-細胞中の単球(CD14+細胞)の促進効果を見い出した点、２） EPC (CD34+細胞)の分化・増幅における細胞間機能性分子としてNotchシグナルの重要性を見い出した点、以上は、今後の研究計画遂行における基盤研究成果であり、次年度以降の円滑な研究計画の実施に繋がると考えられる。
１）平成26年度は、EPC増幅・分化における責任細胞の単球（CD14細胞）と未分化EPCのCD34+細胞間のNotchシグナルを探索する。（１） 末梢血単核球より分画採取したCD14細胞におけるNotchリガンド(Jag-1、DLL4及びDLL1)、CD34+細胞におけるNotchリセプターの発現を定量的PCRやFlow Cytometryにより確認する。（２） Jag-1、DLL4またはDLL1のsiRNAを導入したCD14細胞とCD34+細胞の共培養、あるいはこれらのNotchリガンドの各中和抗を添加したCD14細胞とCD34+細胞の共培養を実施し、CD34+細胞のEPC増幅・分化能抑制効果を検討する。２）平成27年度は、Jag-1、DLL4またはDLL1のsiRNAを導入したCD14+細胞とCD34+細胞の混合細胞群、または共培養細胞群をBalb/cヌードマウスの下肢虚血モデルを作成し、虚血下肢に移植することにより、その血管再生能を生理学的、組織学的に対象細胞移植群と比較する。３）以上の研究により、EPC増幅・分化に寄与する責任細胞分画の単球とCD34+細胞のNotchリガンド・リセプターシグナルによる細胞間クロストークの重要性が証明され、本研究課題の目的達成が可能となる。
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