| 研究課題/領域番号 |
25461137
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
林 寿来 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30533715)
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| 研究分担者 |
中川 修 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (40283593)
坂部 正英 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (00525983)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 細胞間シグナル / 血管内皮細胞 / VEGF / 血管新生 |
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| 研究概要 |
三量体Gタンパクは血管発生や機能維持において、あるいは病態生理学上に必須の細胞間シグナル因子である。三量体Gタンパク相互作用因子として狭心症モデルマウスの心筋から同定されたActivator of G-protein Signaling (AGS) 8は、虚血心筋の側副血行路で発現しており、さらに低酸素下で発現が亢進することから、血管新生におけるAGS8機能の重要性が示唆されるが、これまでのところ詳細な解析はなされていない。本研究では、血管内皮細胞におけるAGS8の意義の解明を目指している。
はじめに、SiRNAによって動脈および静脈由来の培養内皮細胞におけるAGS8のノックダウンを行い、Matrigel tube formation assay によって管腔形成能およびMTT法によって細胞増殖能について検討を行った。その結果管AGS8のノックダウンによって、腔形成能および細胞増職がほぼ完全に抑制されることが明らかになった。興味深い事に同様の結果は、Vascular endothelial growth factor (VEGF)が誘導する管腔形成能および細胞増殖においても認められること、SiRNAによるものと同様の阻害効果はVEGF阻害剤によって抑制されることから、AGS8はVEGFのシグナルを伝達して血管内皮細胞の管腔形成能および細胞増殖を制御していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
[ 課題１ ] Signal pathwayの解析。（１）すでに検討を行ったVEGFAに加えて、既知の血管新生促進因子FGF2、HGF、IGF-1、EGF、NGF、TGF-β1、Cxcl12で細胞を刺激して、AGS8の遺伝子発現変化をRealtime PCRによって検討する。（２）AGS8の発現あるいは活性化を制御する上流因子が見つかれば、Western Blotによってリン酸化Signal Pathwayの同定をおこなう。（３）データベースを用いて転写調節配列の検討を行う。その後、ルシフェラーゼ解析によって候補として挙がった転写因子によるAGS8転写調節活性を検討する。同時に、結合をクロマチン免疫沈降法やゲルシフト解析法によって検証する。
[ 課題２ ] Cellular functionの解析。SiRNAによってAGS8のノックダウンを行った上で、上記増殖因子が誘導する細胞増殖細胞移動、細胞接着、管腔形成がどのように影響を受けるのかについて検討を行う。また心筋細胞の解析で得られた知見から、血管内でも虚血状況下で惹起されるシグナルが、AGS8の発現および細胞機能を調節する可能性がある。低酸素培養器の中で上記同様の解析を行い低酸素下におけるAGS8の発現と細胞機能（細胞増殖、細胞移動、細胞接着、管腔形成）を解析する。
[ 課題３ ] Pathological functionの解析。 現在、加齢性黄斑変性症では網膜でのVEGFの産生が病的血管新生を誘導する憎悪因子として注目されており、血管新生モデルとして非常に適している。誘導される新生血管で、AGS8の遺伝子が発現上昇しているのか、発現部位はどの組織なのか、VEGFによって誘導されるのかなどについてRealtime PCRおよび免疫組織化学的に検討を行う。さらに、作成したAGS8の合成ペプチド、あるいはGβγ特異的阻害剤GalleinをIn vivo投与して、誘導される網膜血管新生が抑制あるいは退縮されるのかについて解析を行い、AGS8-Gβγが臨床上の分子標的に成りうるのかについて検討を行う。
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