研究課題
基盤研究(C)
背景：近年、肥満は喘息のリスク因子であり、肥満喘息患者は減量によって症状が改善することが明らかにされている。また、肥満喘息患者は、喘息治療に対する反応性が悪いことも示されている。肥満においては、胸壁や横隔膜近傍に余剰な脂肪組織が蓄えられること、肺の血流が増加することなどにより物理的に呼吸機能が低下することに加え、肥満に伴い脂肪細胞からの産生が増加するアディポカインが炎症細胞を活性化し、気道炎症を増悪することが報告されている。しかしながら、アディポカインが直接気道構成細胞に及ぼす影響を詳細に検討した報告は少ない。目的：アディポカインの一つであるレプチンが、気道構成細胞である気道上皮細胞に及ぼす影響を明らかにすることを目的とする。方法：ヒト気道上皮細胞株（BEAS-2B）および正常ヒト気道上皮細胞NHBEに、レプチンおよびTNF-α等の炎症制サイトカインを作用させ、realtime PCRおよびLUMINEX assayにより、サイトカイン産生能を解析した。また、レプチンレセプターの発現を、flowcytometryにより解析した。結果：LUMINEX assayにより、レプチンは濃度依存的にBEAS-2BからのIL-6、CCL11、G-CSF、VEGFの産生を亢進し、TNF-αと相加的に作用した。また、realtime PCRにより、レプチンは濃度依存的にBEAS-2BのIL-6、G-CSF、VEGFのmRNA発現を増強した。Flowcytometryにより、BEAS-2BおよびNHBEは、レプチンレセプターを発現することを確認した。考察：肥満が喘息を増悪する機序の一つに、レプチンによる気道上皮細胞からのサイトカイン、ケモカイン、増殖因子の産生能増強効果が存在することが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
今年度はアディポカインの中でもレプチンに焦点を絞り、肺の構造細胞の一つである気道上皮細胞とアディポカインの関連を集中的に解析した。興味深いことに、レプチンは炎症細胞のみならず、肺の構造細胞も強力に活性化することを見出した。一方、レプチンによる気道上皮細胞からのサイトカイン産生についてはデータが蓄積したが、アポトーシス実験、活性化マーカーの発現解析、遊走実験はまだ中途の段階であり、これらのデータがまとまり次第、学術誌に投稿を予定しており、来年度の遅くとも半ばには、結果をまとめられる予定であり、これは計画以上のスピードである。しかしながら、当初の計画では、構造細胞の解析に引き続き、動物モデルを用いた実験を行う予定であったが、動物モデルに関する報告は少ないものの存在し、むしろ臨床検体を用いたデータが不足しており、エビデンスの構築に不可欠であると判断し、引き続き臨床検体を用いた解析を行う方針とした。次のステップとして、患者由来の肺構造細胞を獲得するため、研究計画書は既に当院の倫理審査委員会で承認され、外科医、病理医と共に、細胞の分離培養を開始している段階である。既に今年度約40症例の肺線維芽細胞、気道上皮細胞を取得し、冷凍保存しているため、来年度は速やかに臨床検体の解析を行うことが可能である。これも、大凡計画に沿ったスピードである。
今年度、レプチンによる気道上皮細胞の活性化を認めることが明らかになったため、来年度は引き続き、その活性化機構の解析を進める。具体的には、レプチンによる、気道上皮細胞のアポトーシス実験、増殖実験、活性化マーカーの解析、遊走実験を行う。引き続き、活性を認めた項目に関しては、レプチン或はレプチンレセプターの中和抗体や、SiRNAによるノックダウンにより、その効果が抑制されることを確認する。また、実際のヒト手術検体から分離培養した気道上皮細胞、肺線維芽細胞を用いて検討を行う予定である。この研究に際しては、既に当院の倫理委員会による承諾を得ており、外科医、病理医と連携して、それぞれの細胞の培養系は確立している。また、既に約40症例分の細胞は凍結保存している。それらの細胞を用い、レプチンに対する反応性を解析し、それぞれの患者保存血清のレプチン値を測定し、病理標本の免疫染色でレプチンやレプチンレセプターを染色し、BMIのデータや、呼吸機能検査と併せて、気道上皮細胞とレプチンの関係を包括的に明らかにする予定である。
米国カリフォルニア州で開催された学会（平成２６年３月１日～５日まで５日間の出張）の参加に係る旅費の金額が、院内決裁処理の関係から３月下旬まで確定せず、研究費の残額が確定できなかったことから、次年度使用額が生じた。研究材料等の物品費に使用予定。
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