研究課題
基盤研究(C)
研究代表者はAngptl2が炎症性サイトカイン、活性酸素の産生促進、TGF-β経路を活性化することを明らかにしているが、間質性肺炎におけるAngptl2の役割、その詳細なメカニズムは不明であった。間質性肺炎におけるAngptl2の役割を明らかにするために、まずはヒト肺線維症患者の肺線維化部位におけるAngptl2の発現を免疫染色にて観察し、間質性肺炎の病態とAngptl2発現細胞の関連について検討した。間質性肺炎部位では、マクロファージ及びII型肺胞上皮細胞においてAngptl2の発現を認めた。また、マウスブレオマイシン肺線維症モデルを用いて、肺線維化形成過程におけるAngptl2の発現を検討した。肺線維症モデルが作成できているかを確認するために、経時的に肺組織のHE染色を行った。ブレオマイシン投与後、7日目～14日目において肺の線維化を強く認め、その後線維化は減少した。次に、経時的なAngptl2の発現解析を行った。肺組織におけるAngptl2 mRNAの発現をリアルタイムPCR法、気管支肺胞洗浄液中のAngptl2タンパクをELISA法にて測定した。野生型マウスの肺におけるAngptl2 mRNAの発現は、ブレオマイシン刺激後、7日目までは低下したが、その後上昇した。一方、気管支肺胞洗浄液中のAngptl2濃度は、ブレオマイシン投与後3日目にはやや上昇し、肺修復が促進される7日目以降は無刺激状態の気管支肺胞洗浄液と比較して大きく上昇していた。これらの結果より、ブレオマイシン肺線維症モデルにおいては、急性炎症増悪期には肺実質におけるAngptl2の発現は低下することが明らかとなった。一方、気管支肺胞洗浄液のAngptl2濃度は上昇していることより、Angptl2は修復過程において何らかの機能を有している可能性が示唆された。
1: 当初の計画以上に進展している
マウスブレオマイシンモデルにおいて、安定した肺線維症モデルを作成するためには、一定以上の熟練度が必要とされ、またブレオマイシン投与後の観察期間が長くなるため、モデルを作成してからの解析には時間を要することが予想された。しかしながら、ブレオマイシンの投与法を工夫することにより、安定したモデル作成法が比較的早期に確立できた。今回作成したマウスブレオマイシンモデルの経過は、これまでに報告されているマウスブレオマイシンモデルの表現型と同じ経過であることが確認できた。また、ヒト肺線維症における肺組織の免疫染色では、肺胞マクロファージとII型肺胞上皮細胞においてAngptl2が発現していることが明らかとなった。マウスブレオマイシンモデルの肺組織におけるAngptl2の免疫染色は現在進行中であるが、予備実験において少なくとも肺胞マクロファージ、II型肺胞上皮細胞にはAngptl2が発現している結果を得ている。Angptl2を発現している細胞が、肺胞マクロファージ、II型肺胞上皮細胞であるかは、それぞれの特異的マーカーを用いて二重免疫染色を行う必要性があり、現在その準備も進めている。また、Angptl2の肺における機能が炎症のみならず修復にも関与している可能性が示唆されたことは、肺におけるAngptl2発現の重要性を意味しており、Angptl2ノックアウトマウスもしくはAngptl2トランスジェニックマウスにおける解析が必要であると考えられた。現在、Angptl2ノックアウトマウス、Angptl2トランスジェニックマウスを用いた実験準備を開始しており、これらの点に関しても当初の計画以上に解析が進んでいると考えている。
本年度の結果より、肺線維症におけるAngptl2の発現パターンが明らかとなった。これまでAngptl2の機能は様々な疾患において解析が行われてきたが、その多くは炎症増悪因子として作用するものであった。しかしながら、マウスブレオマイシンモデルにおいてはAngptl2は炎症増悪因子というよりも、修復への関与が示唆されており、非常に興味深い。今後は、Angptl2ノックアウトマウスを用いたマウスブレオマイシンモデルを作成し、線維化の過程をより詳細に解析する予定である。また、マクロファージにAngptl2が発現していることより、骨髄系細胞におけるAngptl2の発現も線維化に関与している可能性が考えられる。そのため、wildマウスの骨髄をAngptl2ノックアウトマウスに移植、Angptl2ノックアウトマウスの骨髄をwildマウスに移植し、ブレオマイシンモデルを作成し解析を行う。Angptl2トランスジェニックマウスに関しては、研究代表者はAP2-Angptl2トランスジェニックマウスを保持している。AP2-Angptl2トランスジェニックマウスでは、主に脂肪組織、マクロファージにおいてAngptl2が強く発現している。そのため、AP2-Angptl2トランスジェニックマウスを用いたブレオマイシンモデルを作成し解析を行う。Angptl2ノックアウトマウス、AP2-Angptl2トランスジェニックマウスは現在繁殖中であり、マウス供給が可能になった時点でモデルを作成し解析を行っていく予定である。また、in vitroの実験として、wildマウス、Angptl2ノックアウトマウスのマクロファージを用いて、様々な刺激における肺線維化に関与する遺伝子発現の解析を行う予定である。
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Molecular Cancer Research
巻: 12 ページ: 239-249
10.1158/1541-7786.MCR-13-0336
