| 研究課題/領域番号 |
25461207
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
稲城 玲子 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (50232509)
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| 研究分担者 |
南学 正臣 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (90311620)
和田 健彦 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (90447409)
大瀬 貴元 東京大学, 医学部附属病院, 臨床登録医 (10568447)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | エピゲノム / 尿細管上皮細胞 / 小胞体ストレス応答 / 酸化ストレス / ATF4 / HIF / 虚血再灌流モデル / microRNA |
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| 研究概要 |
我々はこれまでに、エピゲノムと腎臓病の関係を明らかにする研究の一環として、尿細管上皮細胞に発現するmiRのプロファイリングを行い、その中から尿細管細胞障害時に発現が変動するmiR群を明らかにしてきた。特にmiR205は尿細管に恒常的に発現し、酸化ストレスや小胞体ストレス環境下ではその発現が著明に低下することを報告してきた。
本研究では、miR-205のヒト近位尿細管細胞株（HK-2)における病態生理学的意義の解明を試み、1) miR205は尿細管細胞が酸化ストレス（虚血再灌流後）や小胞体ストレス（tunicamysin, tapsigargin)に曝露すると尿細管細胞障害（生存・増殖率低下や細胞内活性酸素種産生増加）に伴ってその発現が著明に低下するが、逆に虚血ストレス下（1% O2, 24hr）では有意にmiR205発現が亢進すること、２）miR205はprolyl hydroxylase (PHD)1を標的遺伝子としてその発現を制御し、その結果、PHD１標的遺伝子（虚血応答経路転写因子HIFｰ1, 小胞体ストレス応答経路転写因子ATF4）の発現低下、つまりストレス適応反応の低下を招くこと、３）miR205はPHD2、PHD3には作用せず、PHDアイソフォーム特異的な機能特性にも関与することが分かってきた。
虚血再灌流モデルラットを用いたin vivo解析では、腎皮質におけるmiR205の発現は短期間ではin vitroと同様に尿細管細胞障害亢進に伴ってmiR205の発現は低下するが、その後miR205の発現は有意に亢進することが判明した。
以上，尿細管細胞においてストレス障害時にmiR205発現は低下し、PHD1発現調節を介して低酸素応答経路や小胞体ストレス応答経路の不均衡を招くが、尿細管修復時にはmiR205の発現が亢進し尿細管細胞の機能恒常性を回復させる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究において、尿細管細胞において虚血や小胞体ストレス負荷によって発現が変動するmiR群、さらには虚血や小胞体ストレスに対する適応反応経路を制御するmiR群を同定することができた。なかでもmiR205に関しては、その標的遺伝子を同定し、尿細管上皮細胞における機能の一端を明らかにし、腎障害の要因となるストレス（虚血、酸化ストレス、小胞体ストレス）に対して尿細管機能維持に働くmiRのひとつであることを示した。また尿細管障害モデルラットを用いたin vivo試験においても同様の成果を確認することができた。
しかし、同様のストレス下においてmiR205とは明らかに異なる発現変動パターンを示すことが確認できたmiRで、標的遺伝子が同定できていないものがあり、その点は次年度に持ち越された課題である。
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| 今後の研究の推進方策 |
miR205をはじめとする虚血・小胞体ストレス応答経路関連miR群のin vitroにおける病態生理機能解析（前年度の継続課題）に着手する。具体的に、尿細管上皮細胞を用いて、虚血や小胞体ストレス依存的に発現変動する候補miRに対して、gain / loss of function 解析によって、それらの機能解析、病態生理学的関与、虚血・小胞体ストレス応答経路制御における役割などの検討を行う。
方法としては、候補miRを高発現した尿細管上皮細胞の細胞機能解析：ヒト培養尿細管上皮細胞に96 well-plate transfectionにて一過性に候補miRを高発現させ、虚血応答HIF経路、及び小胞体ストレス応答UPR経路を介した細胞表現型に影響を及ぼすmiRの探索を以下の要領で行う。
１）虚血応答HIF経路：候補miRNA群から、虚血（1% O2 24 hr）で誘導されるHIF経路下流遺伝子群、たとえば抗酸化酵素（HO-1, catalase, SOD-1など）の発現や虚血抵抗性を変化させるmiRNAの探索を試みる。HIF経路下流遺伝子群の発現変動は、real-time PCRにて、蛋白発現は免疫細胞染色にて確認する。細胞死は、MTT assay、あるいはtrypan blue exclusionにて評価する。
２）小胞体ストレス応答UPR経路：候補miR群から、小胞体ストレス応答性adaptive UPR経路のレベルを制御するmiRNAの探索を試みる。評価系は小胞体シャペロン検出real-time PCRを用いる。同時にapoptotic UPR経路を制御するmiRをapoptotic UPR関連分子（caspase 12, CHOP）の発現変動を指標に探索する。この際の考慮点としては、小胞体ストレス刺激の程度によってadaptive UPRとapoptotic UPRの活性化バランスが異なるため、小胞体ストレスに対する細胞表現型（ストレス耐性、細胞死）を制御するmiRの探索を合わせて行う。
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