研究課題
申請者らは前年度までの研究成果より、独自に樹立した腎臓由来iPS細胞の中でも腎上皮細胞由来iPS細胞（K-iPS）が最も線維芽細胞由来iPS細胞（F-iPS）と類似した未分化能を有し、腎系統特異的分化誘導に適していると考えた。当該年度の研究では、K-iPSがF-iPSと比べDNA Methylationに相違があることを以前に見出した事より、腎臓構成細胞への分化誘導に最適であると考えた。K-iPSに既報のNature Communicationの報告に従ったアクチビン、レチノイン酸、BMP-7などでの分化誘導法と、Cell Stem Cellsの報告に従った分化誘導法とを比較しながら腎系統特異的分化誘導を目指した。更にK-iPSにEpigenetic ModificationとしてHDAC 阻害剤（Trichostatin A）を処置して、Epigeneticsが分化誘導に及ぼす影響を検討した。iPS細胞への２つの腎系統特異的分化誘導法の検討に関して、既報の方法はその有効性を確認できた。更にF-iPSと比べてK-iPSを用いた方が分化誘導に優れており、腎臓発生・分化因子の発現の相違は時間経過と共にK-iPSの方が増強された。これらの事よりEpigenetic memoryを有するK-iPSの方が腎臓再生には有利に働く可能性が示唆され、DNAメチル化の相違が関係しているものと考えられた。加えてEpigenetics修飾のためHDAC阻害剤(TSA)を添加すると、いずれの腎臓発生因子の発現は増強したが、F-iPSとK-iPSを比較してその発現に相違はなかった。これらの事よりDNAコアヒストンのアセチル化による遺伝子制御が分化誘導に大きく働いるものと考えら、iPS細胞の分化誘導機構においてEpigeneticsの重要性を見出した。
3: やや遅れている
腎上皮細胞由来iPS細胞への腎系統特異的分化誘導法にて、2つの誘導法を試みており、かつ両方法とも線維芽細胞由来iPS細胞と比較、誘導期間のTime courseの検討もしている。また、2つの誘導法も時々、分化発育の遅延があり、一部変法要した誘導法となった。以上より予定していた研究に遅延を生じた。
ヒト腎上皮細胞由来iPS細胞（K-iPS）を使った腎系統特異的分化誘導法が、線維芽由来iPS細胞（F-iPS）と比較して腎臓分化に適していた。その理由の検索にてDNAメチレーション、メチル化プロファイルを未分化、分化K-iPS、F-iPSなどで比較検討して、腎系統への分化を規定する遺伝子群を同定する。同定した遺伝子群をsiRNAでKnockoutすることにより、ヒト腎上皮細胞由来iPS細胞の腎系統へ分化誘導法の機序を解明する。次にin vivoへの応用として、処理した分化系iPS細胞を腹膜皮下、腎被膜下へ移植し、組織学的に腎系統への分化が促進されるかを評価する。in vitro内での分化誘導と違い、in vivo応用での誘導剤の量や誘導期間などの最適条件を検討する必要がある。各分化系iPS細胞移植により得られた腫瘤について、組織学的な評価（病理組織、免疫染色）および腫瘤から抽出した蛋白、RNAサンプルを用いて、腎臓発生・分化マーカーの発現をwestern blot、real time PCRなどで検出する。更により腎臓再生に向けて、細胞移植した組織に対して誘導剤の追加投与なども検討する。
腎上皮細胞由来iPS細胞への２つの腎系統特異的分化誘導法を試したが、分化発育速度が一定しないため誘導法を一部変法した。その為、最適化な誘導法を得るために研究を繰り返し、予定していた研究が遅れた。同系統の研究が続いたため研究費が予定していた額より少なく済んだ。当該年度で残った助成金は次年度の新たな研究で使用する予定である。
次年度は、ヒト腎上皮細胞由来iPS細胞（K-iPS）と線維芽由来iPS細胞（F-iPS）とを腎系統特異的分化誘導法で比較検討する。主にDNAメチレーション、メチル化プロファイルを未分化、分化K-iPS、F-iPSなどで比較して、腎系統への分化を規定する遺伝子群を同定する。同定した遺伝子群をsiRNAでKnockoutすることにより、ヒト腎上皮細胞由来iPS細胞の腎系統へ分化誘導法の機序を解明する。またSCIDマウスへのin vivoの研究も行う予定である。以上より、研究費は多くかかり、予定していた研究費と繰り越した研究費にて対応していく予定である。
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