| 研究課題/領域番号 |
25461212
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
吉田 豊 新潟大学, 医歯学系, 講師 (40182795)
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| 研究分担者 |
矢尾板 永信 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00157950)
山本 格 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30092737)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 腎臓学 / IgA腎症 / IgA免疫複合体 / 凍結腎生検標本 / 糸球体 / プロテオミクス |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、臨床試料（凍結腎生検標本）を用いて、糸球体メサンギウム領域にIgAを主体とする沈着物を認める原発性糸球体腎炎であるIgA腎症において、IgA免疫複合体を構成するタンパク質分子を質量分析計により定性的・定量的に解析することにある。このためには糸球体に沈着するIgA免疫複合体を特異的に単離・精製することが重要である。我々は最初に凍結腎生検試料の薄切切片から糸球体をLaser microdissectionにより回収する方法を用いたが、当然のことながらこの方法で分離した糸球体は大量の血液由来タンパク質が存在し、解析の大きな妨げになる。これを回避するため、前に報告した腎生検試料切片のPBSによる洗浄法を改良し、一定速度の振蕩条件下で３回洗浄することにより、ほとんどの血液由来タンパク質を再現性よく除去できるばかりでなく、不溶性タンパク質成分が相対的に濃縮されることを見出した。また、IgAに対する抗体を用いたタンパク質複合体の蛍光標識法（EMARS法）を確立するため、ラットの腎臓から単離した糸球体を用いてネフリンの細胞外ドメインに対する抗体によりネフリン複合体を特異的に標識する方法を検討した。EMARS法は、標的としたタンパク質の周辺200-300 nmにあるタンパク質を蛍光色素で標識する方法であり、さらに標識の入ったタンパク質を標識に対する抗体を用いて選択的に精製することが可能である。標識されたタンパク質は切片のまま、あるいは溶出後、電気泳動とスキャナーを用いて可視化することができ、また。精製後に複合体タンパク質のみを遊離させて直接的に質量分析で解析することが可能である。現在、腎生検試料から分離した糸球体の解析に十分な感度と持つ方法を確立することを視野に検討を重ねている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１）凍結ヒト腎手術標本切片からlaser microdissectionで回収した糸球体に含まれる大量の血液由来タンパク質を効率的かつ再現性良く除去する方法を確立した。
２）タンパク質複合体を蛍光色素（FITC）で標識するEMARS試薬が市販されていることがわかり、EMARS法を、腎生検試料の解析に至適化するため、動物（ラット）腎臓からシービング法で単離した糸球体を材料にして、ネフリンの細胞外ドメインを認識する抗体を用いてEMARS法の特異性と微量化を検討している。現在のところ特異的な標識結果は得ておらず、さらに検討を要する段階である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）ラット腎臓から単離した糸球体を用いた検討により、細胞外ドメインを認識する抗体を用いて、単離糸球体のような高次立体構造を保った組織の細胞膜タンパク質を標識することが困難であることが分かった場合、手術標本のような比較的大量に入手できるヒト腎皮質の凍結切片を対象にして、比較的よく調べられているネフリン複合体や、インテグリン複合体の標識を検討する。
２）１）の検討で、特異的な標識法が確立された場合には、腎生検試料を用いた検討に入る。問題はIgA腎症の腎生検試料をいかに多く入手できるかに依存しており、現在本学のみならず、IgA腎症症例の多く集まる市中病院、さらには全国的に協力研究者を募り活動も継続して行う予定である。
３）最近、高い分解能、高い質量精度、速いスキャンスピードを持つ、高性能の質量分析計が使用可能になり、質量分析計による解析能力は飛躍的に上がっている。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究分担者の山本格と矢尾板永信の研究経費に残金がでたことが原因である。消耗品の購入にあてたが、残金が生じた。
研究分担者の山本格と矢尾板永信の次年度の研究経費に計上し、消耗品（プラスチック製品等）の購入にあてることを計画している。
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