IgA腎症凍結腎生検標本糸球体のIgAを主体とした沈着物の解析と抗原の同定

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25461212
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 吉田 豊 新潟大学, 研究推進機構, 特任専門職員 (40182795)
• 研究分担者: 矢尾板 永信 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00157950) ; 山本 格 新潟大学, 産学地域連携推進機構, 教授 (30092737)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: IgA腎症 / IgA免疫複合体 / 凍結腎生検標本 / 単離糸球体 / スリット膜 / EMARS法 / プロテオミクス

研究実績の概要

Enzyme-Mediated Activation of Radial Sources (EMARS)法は，生細胞の任意の膜表面タンパク質の近傍（200-300 nm）にあるタンパク質分子群を細胞外から蛍光色素であるfluoresceinで網羅的に標識する方法である。これまでの検討で腎組織では特異的な標識が困難であることがわかったため，最初にラット腎臓から磁気ビーズ灌流法により高度に精製した糸球体を対象として詳細な検討を行った。
スリット膜を構成する主要タンパク質であるネフリンの細胞外領域を認識する抗体（5-1-6モノクローナル抗体）を一次抗体として用い，特異的標識が可能であることがわかったfluorescein-tyramideを標識試薬として使用することにより， EMARS法により，ネフリン周辺のマイクロドメイン（200-300 nm）にある膜表面タンパク質を，一次抗体依存的にfluoresceinにより網羅的に標識することに成功した。可溶化した標識タンパク質はfluoresceinに対する特異的抗体を用いて免疫沈降により濃縮後，トリプシン消化で生成したペプチド試料を高感度・高精度質量分析計を用いて同定したところ，既知のスリット膜構成分子nephrin、Neph1、podocinに加えて，JAM-A，claudin-5，GLEPP1，CAR，CRB2，Thsd7aなどの微量成分まで同定できることがわかった。
最終的な目的は，IgA腎症臨床試料（凍結腎生検標本）を用いたIgA免疫複合体体の解析であり，この課題に大きく近づいたといえる。

研究成果

• [雑誌論文] Avian podocytes, which lack nephrin, use adherens junction proteins at intercellular junctions. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yaoita E, Nishimura H, Nameta M, Yoshida Y, Takimoto H, Fujinaka H, Kawachi H, Magdeldin S, Zhang Y, Xu B, Oyama T, Nakamura F, Yamamoto T
  • 雑誌名: J Histchem Cytochem 巻: 64 ページ: 67-76
  • DOI: 10.1369/0022155415611708
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Unrestricted modification search reveals lysine methylation as major modification induced b tissue formalin fixation and paraffin embedding. (2015)
  • 著者名/発表者名: Zhang Y, Muller M, Xu B, Yoshida Y, Horlacher O, Nikitin F, Garessus S, Magdeldin S, Kinoshita N, Fujinaka H, Yaoita E, Hasegawa M, Lisacek F, Yamamoto T
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 15 ページ: 2568-2579
  • DOI: 10.1002/pmic.201400454
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Label-free quantitative proteomic analysis reveals strong involvement of complement alternative and terminal pathways in human glomerular sclerotic lesions. (2015)
  • 著者名/発表者名: Zhang Y, Xu B, Kinoshita N, Yoshida Y, Tasaki M, Fujinaka H, Magdeldin S, Yaoita E, Yamamoto T
  • 雑誌名: J Proteomics 巻: 123 ページ: 89-100
  • DOI: 10.1016/j.jprot.2015.03.024
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Complementary protein and peptide OFFGEL fractionation for high-throughput proteomic analysis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Magdeldin S, Elguoshy A, Yoshida Y, Hirao Y, Xu B, Zhang Y, Yamamoto K, Takimoto H, Fujinaka H, Kinoshita N, Yamamoto T
  • 雑誌名: Anal Chem 巻: 87 ページ: 8481-8488
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.5b0191
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Datasets from label-free quantitative proteomic analysis of human glomeruli with sclerotic lesions. (2015)
  • 著者名/発表者名: Zhang Y, Xu B, Kinoshita N, Yoshida Y, Tasaki M, Fujinaka H, Magdeldin S, Yaoita E, Yamamoto T
  • 雑誌名: Data Brief 巻: 4 ページ: 180-185
  • DOI: 10.1016/j.dib.2015.05.013
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] EMARS法によるタンパク質複合体解析：腎糸球体上皮細胞足突起間接着装置を構成するタンパク質群の同定 (2016)
  • 著者名/発表者名: 吉田 豊，瀧本裕基，小谷典弘，矢尾板永信
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2016年年会
  • 発表場所: 東京都港区 北里大学
  • 年月日: 2016-07-28 – 2016-07-29
• [学会発表] 培養ポドサイトおける一次突起の誘導 (2016)
  • 著者名/発表者名: 矢尾板永信，吉田 豊，瀧本裕基
  • 学会等名: 第59回日本腎臓学会学術総会
  • 発表場所: 横浜市 パシフィコ横浜
  • 年月日: 2016-06-17 – 2016-06-19
• [学会発表] EMARS法を用いたポドサイトの細胞間接着装置の網羅的解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 瀧本裕基，河内 裕，吉田 豊，矢尾板永信
  • 学会等名: 第59回日本腎臓学会学術総会
  • 発表場所: 横浜市 パシフィコ横浜
  • 年月日: 2016-06-17 – 2016-06-19
• [備考] 新潟大学医歯学総合研究科腎研究施設構造病理学分野ホームページ
  • URL: http://www.kidney-niigata.org/strpath/ind_j.html
• [備考] Human Kidney and Urine Proteome Projectホームページ
  • URL: http://www.hkupp.org/