進行性腎障害における免疫調整性マクロファージの機能解析と細胞移入治療効果の検討

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25461215
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 坪井 直毅 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (50566958)
• 研究分担者: 丸山 彰一 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (10362253) ; 秋山 真一 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師 (20500010)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: マクロファージ / 炎症 / 糸球体腎炎 / 免疫調整

研究実績の概要

近年、マクロファージには、急性期炎症を担うclassically activated macrophage（M1）と炎症を鎮静化させ組織修復を担うalternative activated macrophage(M2)が存在することが示されている。腎疾患においては、明らかな免疫応答による腎炎の場合はもちろん、慢性腎臓病（CKD）全般でも腎組織へのマクロファージ浸潤が認められ、マクロファージは腎炎やCKDの発症とその進展に大きな役割を果たしていると考えられてきた。本研究の目的は進行性腎障害進展過程におけるM2型Mφのサブタイプ別組織局在・機能を解析し、人為的に誘導したM2型Mφの動物モデルへの移入による腎障害改善効果を明らかにすることである。H25年度に進行性腎障害のヒト腎生検組織における、CD163陽性M2型Mφ分布局在を組織学的に検討した結果、細胞増殖が高度で活動性の高いループス腎炎に特に陽性細胞の増加が目立った。そこでさらにループス腎炎糸球体上のCD163陽性M2型Mφに発現する、他のマーカー抗原解析を免疫組織染色を用いて行うとともに、ループス腎炎の標本数を増加し、組織学的、臨床的パラメーターと腎臓におけるCD163陽性M2型Mφ数との相関解析を行った。また動物実験では、マウス骨髄細胞よりIL4,IL-13共刺激によりin vitroでCD206陽性M2型Mφへ分化させ、マウス抗基底膜抗体型腎炎モデルに投与してその治療効果を、腎機能的、組織学的に詳細に検討した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(1)進行性腎障害におけるM2型Mφの局在および集積時期の詳細検討:H25年度はヒト腎生検サンプルを用いたCD163陽性M2型Mφの組織染色で、細胞増殖が高度で活動性の高い腎炎、特にループス腎炎において陽性細胞の増加をみた。H26年度はさらに標本数を増やし、CD163陽性M2型Mφ細胞数を、ループス腎炎class毎に評価したところIV型で著明な細胞増加が認められた。糸球体におけるCD163陽性M2型Mφは汎マクロファージマーカーであるCD68陽性Mφ数あるいは他のM2マーカーであるCD204陽性Mφ数と強い相関(それぞれr=0.887,r=0.894)がみられた。CD68,CD163,CD204いずれかの二重染色による同一Mφ上での各抗原発現評価を行ったところ、CD68陽性細胞の約70%、CD204陽性細胞の約85%がCD163陽性であった。
(2) M2型Mφ投与による腎障害改善効果の検討:マウス骨髄由来MφからIL-4+IL-13刺激によりM2型 Mφを誘導した。こうして得たM2型 Mφを、代表的な進行性腎障害モデルである抗基底膜抗体型腎炎モデルに投与し、障害改善効果を検討した。蛋白尿はCD206陽性M2型 Mφ投与群において優位に減少した。21日目の組織学的検討ではPAS染色陽性部位の優位な減少が同じく細胞治療群において認められた。また治療群では糸球体における好中球数、マクロファージ数、CD3+CD4+陽性Tリンパ球数集積が有意に改善した。
(3) CD163陽性M2型Mφ特異的に除去するトランスジェニックマウス作製と腎障害における機能解析：H25年度に検討した抗基底膜抗体型腎炎モデルでの糸球体CD163染色において有意な陽性細胞がみられなかったことより、引き続き当実験計画は中断している。
(4) CD206陽性M2型Mφの腎障害における機能解析:共同研究者富山大学戸邉一之研究室で作成されたCD206-DTRTgマウスを当研究室で繁殖したが、ジフテリア投与後のCD206陽性細胞除去効率が、継代するに従い低下したため、新たに新しいラインを導入計画中である。

今後の研究の推進方策

(1)進行性腎障害におけるM2型Mφの局在および集積時期の詳細検討:血中および尿中可溶性CD163濃度をELISA法で測定し、腎組織所見やCD163陽性M2型Mφ集積度、蛋白尿などとの関連を調べ、同様に検討したMCP-1とループス腎炎の活動性としての有用性を比較検討する。
(2)M2型Mφ投与による腎障害改善効果の検討:CD206陽性M2型Mφ治療による抗基底膜抗体型腎炎改善効果を、IL-6,MCP-1,IL-1βand TNF-αなどの腎サイトカインプロファイルの面から検討する。また投与細胞の臓器分布を、蛍光標識やEGFPトランスジェニックマウスから誘導したCD206陽性M2型Mφを用い評価する。
(3)CD163陽性M2型Mφ特異的に除去するトランスジェニックマウス作製と腎障害における機能解析：引き続きCD163陽性M2型Mφの腎臓内発現を別の抗体を用いて試みる。
(4)CD206陽性M2型Mφの腎障害における機能解析:CD206-DTRTgマウスの再繁殖を行い、ジフテリアトキシンによるCD206陽性M2型Mφ除去による効果を各種マウス腎障害モデルにおいて検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Neutrophil/lymphocyte ratio as a predictor of cardiovascular events in incident dialysis patients: a Japanese prospective cohort study. (2014)
  • 著者名/発表者名: Abe T, Kato S, Tsuruta Y, Sugiura S, Katsuno T, Kosugi T, Tsuboi N, Matsuo S, Maruyama S.
  • 雑誌名: Clin Exp Nephrol 巻: Epub ページ: Epub
  • 査読あり
• [雑誌論文] Patient age and the prognosis of idiopathic membranous nephropathy. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi M, Ando M, Yamamoto R, Akiyama S, Kato S, Katsuno T, Kosugi T, Sato W, Tsuboi N, Yasuda Y, Mizuno M, Ito Y, Matsuo S, Maruyama S.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9(10) ページ: e110376
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0110376.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pristane-induced granulocyte recruitment promotes phenotypic conversion of macrophages and protects against diffuse pulmonary hemorrhage in Mac-1 deficiency. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shi Y, Tsuboi N, Furuhashi K, Du Q, Horinouchi A, Maeda K, Kosugi T, Matsuo S, Maruyama S.
  • 雑誌名: J Immunol 巻: 193(10) ページ: 5129-39
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1401051
  • 査読あり
• [雑誌論文] Smoking is a risk factor for the progression of idiopathic membranous nephropathy. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi M, Ando M, Yamamoto R, Akiyama S, Kato S, Katsuno T, Kosugi T, Sato W, Tsuboi N, Yasuda Y, Mizuno M, Ito Y, Matsuo S, Maruyama S.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9(6) ページ: e100835
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0100835
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rat adipose tissue-derived stem cells attenuate peritoneal injuries in rat zymosan-induced peritonitis accompanied by complement activation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kim H, Mizuno M, Furuhashi K, Katsuno T, Ozaki T, Yasuda K, Tsuboi N, Sato W, Suzuki Y, Matsuo S, Ito Y, Maruyama S.
  • 雑誌名: Cytotherapy 巻: 16(3) ページ: 357-68
  • DOI: 10.1016/j.jcyt.2013.10.011
  • 査読あり
• [雑誌論文] A ray of light in the dark: alternative approaches to the assessment and treatment of ischemic nephropathy. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsuboi N, Maruyama S, Matsuo S, Imai E.
  • 雑誌名: Nephrol Dial Transplant 巻: 29(2) ページ: 228-31
  • DOI: 10.1093/ndt/gft463
  • 査読あり
• [学会発表] A RISE IN ANTI-NEUTROPHIL CYTOPLASMIC AUTOANTIBODY (ANCA) TITERS IS AN INDEPENDENT PREDICTOR OF RELAPSE IN ANCA-ASSOCIATED VASCULITIS (2015)
  • 著者名/発表者名: M. Yamaguchi, S. Kato, T. Katsuno, N. Kato, T. Kosugi, N. Tsuboi, Y. Yasuda, Y. Ito, S. Matsuo, S. Maruyama
  • 学会等名: World Congress of Nephrology 2015
  • 発表場所: Cape Town（South Africa）
  • 年月日: 2015-03-13 – 2015-03-17
• [学会発表] Mac-1 Deficiency Exacerbates Glomerulonephritis In Experimental Model Of Systemic Lupus Erythematosus. (2015)
  • 著者名/発表者名: Y. Shi, N. Tsuboi, S. Matsuo, S. Maruyama
  • 学会等名: World Congress of Nephrology 2015
  • 発表場所: Cape Town（South Africa）
  • 年月日: 2015-03-13 – 2015-03-17
• [学会発表] Association of Glomerular Macrophage Phenotypes and Urinary Soluble CD163 with Disease Activity in Human Lupus Nephritis (2014)
  • 著者名/発表者名: Nobuhide Endo, DrMed, Naotake Tsuboi, MD, PhD, Kazuhiro Furuhashi, MD, PhD, Shoichi Maruyama, MD, Seiichi Matsuo, MD.
  • 学会等名: Kidney Week 2014
  • 発表場所: フィラデルフィア (米国)
  • 年月日: 2014-11-11 – 2014-11-16
• [学会発表] Smoking Is a Risk Factor for the Relapse of Antineutrophil Cytoplasmic Antibody (ANCA)-Associated Vasculitis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Makoto Yamaguchi, MD, Sawako Kato, MD, PhD, Takuji Ishimoto, MD, PhD, Tomoki Kosugi, MD, PhD, Waichi Sato, MD, PhD, Naotake Tsuboi, MD, PhD, Masashi Mizuno, MD, PhD, Yasuhiko Ito, MD, PhD, Seiichi Matsuo, MD, Shoichi Maruyama, MD.
  • 学会等名: Kidney Week 2014
  • 発表場所: フィラデルフィア (米国)
  • 年月日: 2014-11-11 – 2014-11-16
• [学会発表] PRESの画像所見を呈し、血漿交換と免疫抑制治療が奏効したNP-SLEの一例 (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 一洸、田中 章仁、勝野 敬之、加藤 規利、鈴木 康弘、加藤 佐和子、石本 卓嗣、尾崎 武徳、小杉 智規、安田 宣成、佐藤 和一、坪井 直毅、水野 正司、伊藤 恭彦、丸山 彰一、松尾 清一
  • 学会等名: 第44回日本腎臓学会西部学術大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2014-10-03 – 2014-10-04
• [学会発表] 生体腎移植後に発症したPost-transplant lymphoproliferative disease (PTLD)の一例 (2014)
  • 著者名/発表者名: 酒井 尊之、鈴木 康弘、坂田 史子、加藤 規利、勝野 敬之、石本 卓嗣、小杉 智規、佐藤 和一、坪井 直毅、水野 正司、丸山 彰一、伊藤 恭彦、松尾 清一
  • 学会等名: 第44回日本腎臓学会西部学術大会
  • 発表場所: 神戸商工会議所(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2014-10-03 – 2014-10-04
• [学会発表] 筋痛症状を呈し、CAPD継続が危惧されたPMRの2症例 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小崎 陽平、鈴木 康弘、坂田 史子、加藤 規利、勝野 敬之、石本 卓嗣、小杉 智規、佐藤 和一、坪井 直毅、水野 正司、丸山 彰一、伊藤 恭彦、松尾 清一
  • 学会等名: 第44回日本腎臓学会西部学術大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2014-10-03 – 2014-10-04
• [学会発表] 喫煙と特発性膜性腎症の腎予後との関連性について (2014)
  • 著者名/発表者名: 山口 真、安藤 昌彦、秋山 真一、加藤 佐和子、勝野 敬之、小杉 智規、佐藤 和一、坪井 直毅、安田 宜成、水野 正司、伊藤 恭彦、松尾 清一、丸山 彰一
  • 学会等名: 第57回日本腎臓学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
  • 年月日: 2014-07-04 – 2014-07-06
• [学会発表] CD163陽性マクロファージ糸球体浸潤ならびに尿中可溶性CD163のループス腎炎活動性指標としての有用性 (2014)
  • 著者名/発表者名: 遠藤 信英、坪井 直毅、松尾 清一、丸山 彰一
  • 学会等名: 第57回日本腎臓学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市))
  • 年月日: 2014-07-04 – 2014-07-06
• [学会発表] 腹膜透析患者におけるC.E.R.A.投与量に関連する因子の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 康弘、坂田 史子、勝野 敬之、加藤 規利、尾崎 武徳、小杉 智規、佐藤 和一、坪井 直毅、丸山 彰一、水野 正司、松尾 清一、伊藤 恭彦
  • 学会等名: 第59回日本透析医学会学術総会・集会
  • 発表場所: 神戸ポートピアホテル(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2014-06-12 – 2014-06-15
• [学会発表] 長期腹膜透析（PD）患者に生じた左房内calcified amorphous tumor（CAT）の1例 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田中 章仁、水野 正司、大島 英揮、筑紫 さおり、石川 英昭、坂田 史子、加藤 規利、鈴木 康弘、勝野 敬之、尾崎 武徳、小杉 智規、坪井 直毅、佐藤 和一、丸山 彰一、松尾 清一、伊藤 恭彦
  • 学会等名: 第59回日本透析医学会学術総会・集会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2014-06-12 – 2014-06-15
• [学会発表] Spironolactone improving intrarenal renin-angiotensin system activation in type ２diabetic nephropathy patients with overt albuminuria. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sawako Kato, Shoichi Maruyama, Hirofumi Makino, Jun Wada,Takashi Uzu, Hisazumi Araki, Daisuke Koya, Keizo Kanasaki, Akira Nishiyama, Hiroyuki Kobori, Enyu Imai, Masahiko Ando, Yutaka Oiso, Seiichi Matsuo
  • 学会等名: The 14th Asian Pacific Congress of Nephrology
  • 発表場所: 品川プリンスホテル(東京都港区)
  • 年月日: 2014-05-14 – 2014-05-17