| 研究概要 |
1. 副腎皮質H295R細胞におけるアンジオテンシノーゲンの転写活性に重要な領域の絞込み：アンジオテンシノーゲン遺伝子のCpGサイトに関しては上流のUSF1, ESR1, CEBPB,NR3C1, HNF4Aが報告され(Circ Res 2008;103:940), 複数のCpGアイランドが存在している。H295R細胞を用いて, ルシフェラーゼレポーターアッセイを行い、 5’-RACEで同定した各遺伝子のプロモーターを含む連続した5’deletion constructを作製し, 細胞にトランフェックションし, プロモーター転写活性に重要な領域を絞り込んだ。
2. 転写因子と結合領域の同定：絞り込んだプロモーター領域について、TESS (Transcription Element Search System)を用いて、転写因子結合領域(cis-acting element)及び転写因子を推定した。次に、EMSA(Gel shift assay)を行い、in vitroにおけるタンパク-DNA結合を証明した。その際、候補の転写因子に対する抗体を用いてsupershiftを観察し、そのDNA配列(cis-acting element)と候補転写因子との結合を示した。次にルスフェラーゼの5’deletion constructに転写因子結合領域の遺伝子異常を導入し、プロモーター活性の消失或いは減弱することを示した。
3.細胞内における転写因子と結合領域との結合 (タンパク-DNA interaction)：ChIP (Chromatin immunoprecipitation assay)を行い、 H296R細胞内におけるタンパク-DNA interactionを証明した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. ラットに高食塩食及び低食塩食を投与し血管、心臓、腎臓、副腎におけるアンジオテンシノーゲンのメッセンジャーRNA(mRNA)及びタンパク発現の定量, DNAメチル化状態を測定し, 正食塩食投与ラットと比較検討する。mRNAの定量はreal-time PCR,タンパク発現はウェスタンブロット法を用いる。11β-HSD2酵素活性は3Hでラベルしたプレカーサーを用いてHPLCにて分離し測定する。MR活性は3H-aldosteroneを用いて結合実験により評価する。各因子のプロモーター領域のDNAメチル化状態はバイサルファイトシークエンス法により評価する。
2. アンジオテンシンIIブロッカー, アルドステロンブロッカーを投与し、同様の検討を行う。
3. 食塩感受性高血圧モデル動物を用いて同様に検討する。
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