研究課題
基盤研究(C)
これまで申請者らは腎生検組織を用いた網羅的発現遺伝子解析により、高血圧/糖尿病に特有な発現変動を示す遺伝子としてアンジオテンシンIV受容体（AT4）を抽出、想定される可溶成分（sAT4）に対してポリクローナル抗体による感度0.01nmol/mlレベルの測定系を確立しました。臨床症例652例の血漿濃度の測定では、陽性群で有意にBMIが低値であり、かつ有意にアンジオテンシンIが低値であるとの成績が得られ、生物学的な解釈としても整合性のある成績と考えられました。しかしながら感度については、血漿での陽性率が14.3%と必ずしも高くありません。そこでモノクローナル抗体による高感度測定系を確立することにより臨床上大変有意義なバイオマーカーとなることが強く期待され、これを構築し臨床症例で評価することを目的としました。このため、抗原タンパク質（標準物質）としての人工合成遺伝子を作製し、発現細胞により培養調製し、次にマウスを免疫しハイブリドーマを作製、クローニングしモノクローナル抗体を精製、高感度ヒトsAT4 ELISAキットを構築する実験系を計画しました。初年度にあたりまずは、抗原タンパク質の人工合成遺伝子の作製、発現細胞による培養調製まで進めました。この経過で、培養調製した細胞において発現ベクターの構築によるCHO細胞における発現を確認しましたが、十分な収量が得らなかったため、リコンビナントタンパクによるモノクローナル抗体の作成に切り替え、これによるモノクローナル抗体作成のためのマウスの免疫を開始しました。今後得られる抗体群と既に作成済みのポリクローナル群との組み合わせにより高感度測定系の構築を進めて参ります。
2: おおむね順調に進展している
研究計画の全体的な過程としては、抗原タンパク質（標準物質）の人工合成遺伝子を作製し、発現細胞により培養調製し、マウスを免疫し抗体価上昇後ハイブリドーマを作製、クローニングしモノクローナル抗体を精製、高感度ヒトsAT4 ELISAキットを構築し、臨床症例で測定・評価するという概要です。現時点では諸方法を試みた上で、人工合成遺伝子によるタンパク質の合成は困難であると判断し、ただちにリコンビナントタンパクを入手し、ハイブリドーマ作製の過程に進んでおります。以上より達成度として、おおむね順調に進展していると自己評価いたしたく存じます。
初年度の進行状況を踏まえ、今後当初の計画に沿って、免疫したマウスの抗体価上昇後、脾臓・リンパ節から、ハイブリドーマを作製、スクリーニングし、適当数をクローニング、培養後上清からモノクローナル抗体を精製します。これをビオチン標識し、申請者らがすでに作製しているポリクローナル抗体を含めた組み合わせ試験により最も良好なセットを選出します。最終的にHRP標識したFab’部位の抗体を作製、適正な測定諸条件、再現性などを検討し、高感度ヒトsAT4 ELISAキットを完成します。完成した高感度測定系を用い、臨床症例での測定を実施し、既知のRA系マーカーやインスリン抵抗性マーカーとの関係を解析し、各種疾患の発症・進展における関係を解析します。これにより、臨床上大変有用な新規バイオマーカーの確立を目指します。
すべて 2014 2013
すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件)
J Postgrad Med
巻: 60 ページ: 211
10.4103/0022-3859.132369
Acta Diabeto
巻: in press ページ: in press
-
Int J Cardiol
巻: 166 ページ: 448-452
10.1016/j.ijcard.2011.10.133
Am J Med Sci
巻: 346 ページ: 302
10.1097/MAJ.0b013e3182639555
動脈硬化予防
巻: 12 ページ: 50-57
循環器内科
巻: 74 ページ: 345-350
循環plus
巻: 13 ページ: 7-9
