| 研究実績の概要 |
これまで申請者らは腎生検組織を用いた網羅的発現遺伝子解析により、高血圧/糖尿病に特有な発現変動を示す遺伝子としてアンジオテンシンIV受容体（AT4）を抽出、想定される可溶成分（sAT4）に対してポリクローナル抗体による感度0.01nmol/mlレベルの測定系を確立しました。臨床症例652例の血漿濃度の測定では、陽性群で有意にBMIが低値であり、かつ有意にアンジオテンシンIが低値であるとの成績が得られ、生物学的な解釈としても整合性のある成績と考えられました。しかしながら感度については、血漿での陽性率が14.3%と必ずしも高くありません。そこでモノクローナル抗体による高感度測定系を確立することにより臨床上大変有意義なバイオマーカーとなることが強く期待され、これを構築し臨床症例で評価することを目的としました。
このため、まず抗原タンパク質（標準物質）としての人工合成遺伝子を作製し、発現細胞により培養調製し、次にマウスを免疫しハイブリドーマを作製、クローニングしモノクローナル抗体を精製、高感度ヒトsAT4 ELISAキットを構築する実験系を計画しました。初年度の平成25年度には、人工合成遺伝子の作製、培養調製まで進め、て発現ベクターの構築によるCHO細胞での発現を確認しましたが、収量が十分であり、リコンビナントタンパクによるモノクローナル抗体作成に切り替えました。
マウスの免疫、脾臓、リンパ節とX63との細胞融合を行い、上清によるスクリーニングを進め、clone: 46A1, 48A3, 55A2, 57A2, 62A2, 77A1を選択、サンドイッチELISA法による組み合わせ試験を複数ステップで実施し徐々に選別した結果、固相化側に77A1、標識側に46A1-Fab’を用いる組み合わせが最適と考えられ最終決定としました。その後、各種の測定条件の適正化を進め、再現性等のチェックを実施しています。引き続き臨床検体で測定し各種病態における意義を解析します。
|
