研究課題
基盤研究(C)
本年度は，中脳・線条体のロテノン神経障害の差異に相関したアストロサイト発現因子の同定を行った．SD系ラット胎仔(15日齢)からの中脳神経細胞にロテノン(1-5 nM)を48時間暴露した中脳あるいは線条体アストロサイトからの培養液を添加したところ，ロテノン曝露線条体アストロサイトからの培養液添加ではチロシン水酸化酵素(TH)陽性細胞数に変化はみられなかったが，ロテノン曝露中脳アストロサイトの培養液添加ではTH陽性ドパミン(DA)神経細胞数が有意に減少した．そこで，中脳あるいは線条体アストロサイト単独培養系を用いてロテノン(5 nM)を24時間添加し，cDNAマイクロアレイを行った．ロテノン処置により発現誘導される遺伝子を検索した結果，中脳アストロサイトにおいてのみ発現誘導されるものにNFATc3遺伝子があった．そこで，中脳あるいは線条体アストロサイトにロテノン(1-5 nM)を添加し，24時間後に核蛋白を抽出し，NFATc3の核移行をWestern blotにより検討した．その結果，中脳アストロサイトにおいてのみ，ロテノン(5 nM)暴露で，NFATc3の核内発現量が有意に増加していた．さらに，中脳あるいは線条体アストロサイトを無血清培地にて培養し，ロテノン(5 nM)で48時間処置した後，上清を回収し，サイトカインアレイを行った．その結果，ロテノン処置により中脳アストロサイトの培養上清中においてFas ligand, L-selectin, インターフェロンγ，インターロイキン(IL)-10, IL-13などのNFAT関連分子の誘導がみられ，これらロテノン処置によるサイトカインの分泌は線条体アストロサイトではみられなかった．以上の結果より，ロテノン誘発DA神経障害には中脳アストロサイトでのNFAT活性化，炎症性サイトカインの分泌が関与する可能性が示唆された．
1: 当初の計画以上に進展している
本年度は，ロテノン誘発ドパミン神経障害をもたらすアストロサイト発現因子の同定を行った．その結果，ロテノン暴露によるドパミン神経障害に相関して，中脳アストロサイトにおけるNFATc3の核移行ならびにNFAT関連分子(Fas ligand, L-selectin,インターフェロンγ，インターロイキン(IL)-10, IL-13)の細胞外への分泌が確認された．これにより，ロテノン誘発ドパミン神経障害を規定しうる因子として中脳アストロサイトにおけるNFAT関連分子を見出した．また，これらの知見は脳部位特異性があることから，次年度以降の腸管・嗅球における神経障害への関与が期待できる．
ロテノン誘発ドパミン神経障害への中脳アストロサイトにおけるNFAT関連分子の関与について詳細に検討する．中脳アストロサイトのNFATc3発現をsiRNAによるノックダウンで低下させ，ロテノン処置によるドパミン神経障害発現の有無を検討する．SDラット胎仔の腸管，新生仔の嗅球から初代培養神経・アストロサイト(様細胞)共培養系をそれぞれ作製し，ロテノンを24-48時間添加し，腸管神経叢および嗅覚二次ニューロン(僧帽細胞および房飾細胞)の神経障害を免疫染色により経時的に評価する．また，アストロサイト(様細胞)単独培養系を用いて，神経障害の惹起された条件でロテノン処置したアストロサイト(様細胞)の培養上清を神経細胞に添加し，神経障害発現の有無を検討する．さらに，NFATc3の核移行性およびNFAT関連分子の発現変化について検討する．
初年度は嗅球および腸管の初代培養実験ではなく，中脳の初代培養での詳細な検討を行ったため，多くの妊娠ラットを必要としなかった．そのため妊娠ラットに必要として計上していた経費の一部にあたる358,999円を次年度に使用することとなった．次年度平成26年度の請求研究費とあわせて，動物実験，培養実験のための消耗品費として使用する予定である．
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Biol. Pharm. Bull.
巻: 37 ページ: 327-330
http://dx.doi.org/10.1248/bpb.b13-00749
Am. J. Physiol.-Renal Physiol.
巻: 306 ページ: F105-115
10.1152/ajprenal.00034.2013
J. Pharmacol. Sci.
巻: 124 ページ: 313-319
http://dx.doi.org/10.1254/jphs.13R19CP
巻: 122 ページ: 34-41
10.1254/jphs.13015FP
PLoS ONE
巻: 8 ページ: e65983
10.1371/journal.pone.0065983
Neurobiol. Dis.
巻: 59 ページ: 244-256
10.1016/j.nbd.2013.08.003
九州栄養福祉大学研究紀要
巻: 10 ページ: 179-191
神経内科
巻: 79 ページ: 257-261
