| 研究課題/領域番号 |
25461288
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
大島 洋一 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50516060)
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| 研究分担者 |
徳田 隆彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80242692)
笠井 高士 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70516062)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | アルツハイマー病 / アミロイドβ蛋白 / ELISA / オリゴマー / アミロイド前駆蛋白 |
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| 研究概要 |
家族性アルツハイマー病の原因であるアミロイド前駆蛋白(APP)変異遺伝子を導入した細胞に共通するアミロイドbeta(Abeta)蛋白の動態を解明するため、生理的な細胞内蛋白代謝を解析できるFlp-In T-RExシステム(Invitrogen)を用いた。pcDNA5/FRT/TO vectorにヒト野生型APP695 DNA、Swedish(K670NM671L)、Dutch(E693Q)、London(V717I)、Osaka(E693delta)型APP DNAを導入した。野生型APPと各変異型APPが導入されたplasmid DNAをFlp-InT-REx293細胞にトランスフェクションし、ハイグロマイシンでセレクションをかけ、stable cell lineを確立した。細胞中のAPP発現は免疫染色とWesternblottingで検出した。細胞外のAbeta1-40、Abeta1-42、Abeta oligomer量を解析するために、細胞を2日間37度で培養後、培地を回収し、ELISAを用いて定量した。培地中のAbeta1-40量はSwedish型APPを導入した細胞で野生型APPよりも約10倍高値だった。Abeta1-42量はSwedish型とLondon型APPの細胞で野生型よりも有意に高値を示した。培地中のAbeta oligomer量は変異型APPで高い傾向を示した。野生型APP, 家族性アルツハイマー病の変異型APPを安定に発現する細胞を作製し、細胞外Abeta monomer, Abeta oligomerを定量することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
家族性アルツハイマー病の原因である変異型APP遺伝子と野生型APPをpcDNA5/FRT/TO vectorに導入し、Flp-In T-REx293 cellにトランスフェクションさせて、stable cell lineを作製することができた。APP遺伝子を導入したFlp-In T-REx293 cellでは免疫染色・WesternblottingでAPPが安定に発現していることを確認できた。これらの細胞を用いて、細胞外Abeta1-40、Abeta1-42量、Abeta oligomer量をELISAで測定し、Abeta monomer, Abeta oligomerの細胞外分泌量を解析することができた。今回の研究結果は当初記載した計画に沿ってほぼ進められたと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．共焦点レーザ走査型顕微鏡による細胞内Aβ関連蛋白の局在と細胞内動態の解析
Flp-In T-REx 293 cellにおいて、Abeta monomer、Abeta oligomer抗体で免疫染色を行い、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて Abeta蛋白の細胞内局在を観察する。細胞輸送系に関してはEEA1 antibody、Lamp-1 antibodyの共染色により分布を解析する。またendosome・lysosome inhibitorを用いて、Abeta関連蛋白の細胞内動態を解析する。
２．Flp-In T-REx293細胞系における細胞内外Abeta monomer, Abeta oligomerの定量
細胞内のAbeta1-40、Abeta1-42、Abeta oligomer量を解析するために、細胞を2日間37度で培養後、cell lysateを回収し、ELISAを用いて定量する。またFlp-In T-REx293細胞系にメマンチンやニコチンなどアルツハイマー病発症に関係する試薬を添加した際、細胞内外のAbeta蛋白量に変化があるかを解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今回当該助成金を家族性アルツハイマー病変異型APP DNAの作製、各変異遺伝子のFlp-In T-REx293細胞へのトランスフェクション、細胞外Abeta1-40, Abeta1-42、Abeta oligomerをELISAで定量するのに使用した。当初の予定よりも早くFlp-In T-RExシステムが完成し、試薬の節約を行うことができた。
細胞内外のAbeta monomer及びAbeta oligomerをELISAで定量する以外他に、免疫染色・Westernblottingを用いて解析する予定である。またELISA結果の再現性について更に検討する予定である。この研究に、次年度研究助成金を割り当てる方向である。
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