研究課題
本年度は昨年構築したエクソン51スキップ用の9型AAV/改変U7 SnRNAカセットについて長期投与の検討を行った。6か月投与でもスキッピングの持続が確認された。長期投与でも有効性が確認された。2種類のコンストラクトでは大きな差は見られなかった。また並行して、同ウイルスの全身投与を行っている。骨格筋・心臓でのskippingも見られたが、効率が低いために、用量を漸増して、検討を行っている。一部でマウスの死亡例があり、今後 原因を探索中である。一方で45-55マルチスキップだが、昨年、報告したように、11種類のアンチセンスでskippigが見られたので 4種類のDMD患者線維芽細胞からmyoDで分化させた筋芽細胞で検討した。対象としたのはエクソン45-50欠損、46-50欠損、48-52欠損、54欠損のDMD患者由来でいずれも45-55スキップでin-frame化する。いずれも高濃度では45-55スキップ一致するバンドが観察された。しかしながら、ウェスタンブロットでは、蛋白の発現が確認されなかった。AAVベクターに組み込んだ場合、長期投与によりジストロフィンタンパク質の発現の可能性はあるが、現在配列を含めて見直し中である。
2: おおむね順調に進展している
局所投与は、長期投与のスキッピング効果も確認できている。また全身投与に関しては、スキッピングの効果も確認できており、概ね順調と考えている。ヒトへのマルチ・スキッピングはDMD由来の4種類の対象細胞で、スキッピングを確認できており、こちらもおおむね順調と考えている。
マウスの全身投与に関しては、投与濃度の調節を行い、全身でより効果的な発現を目指しつつ、長期的な安全性と効果を検証する。一方でヒトに関しては、配列を見直しつつ、AAVベクターへの組み込みを行い、その効果を検証する予定としている。
本来、45-55スキップ用の遺伝子合成(4kbp クローニング不可の為に外注)とAAVウイルス作製に使用予定だったが、配列の改変のために、来年度に持ち越しとなった。
本年度に、配列を決定して、遺伝子合成を行い、ウイルスを作製して使用予定としている。
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