研究課題
本年度はこれまで構築したエクソン51スキップ用の9型AAV/改変U7 SnRNAカセットについて更に長期投与の検討を行った。ssAAVには、エクソン51に対する2配列をそれぞれ5個づつのタンデムで発現し、scAAVに対しては、それぞれ一種類づつ導入している。局所投与後、12か月以上でも両者でスキッピングの持続が確認され、ウエスタン・ブロットでも発現確認できた。また経過中にマウスに特に影響は見られなかった。局所投与では両者に効果の差はなく、scAAVでも十分に効果があるとか考えられる。全身投与に関しては昨年度の結果を踏まえ、用量を増加して、検討した。用量の増加により1か月後の骨格筋・心臓でのskippingが確認された。1年以上の長期投与では、skipping効率は落ちるがskippingの持続は確認された。特に経過中にマウスに異常は認めなかった。一方で45-55マルチスキップでは昨年報告した11種類のアンチセンスでskippingが見られたが、ジストロフィンの発現が見られなかったために、用量を増加して昨年度と同じ 4種類のDMD患者線維芽細胞からmyoDで分化させた筋芽細胞で検討した。対象としたのはエクソン45-50欠損、48-52欠損、54欠損、46-50欠損のDMD患者由来でいずれも45-55スキップでin-frame化する。mRNAの解析では45-55スキップ一致するバンドが観察された。しかしながら、ウェスタン・ブロットでは、45-51、48-53、54-55スキップに一致するジストロフィンの発現は確認されたが、45-55スキップに一致するジストロフィンは確認できなかった。このことは45-55 skippingはmRNAレベルでは起こるが、より長いin-frameしたmRNAからのジストロフィン転写が細胞内で優先されており、今後、更なる配列の調整が必要と考えられた。
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