研究課題
膵臓β細胞はインスリン分泌を機能とするが、単一細胞では分泌応答が極度に減弱しており、β細胞凝集体である膵島を構成することで必要に応じたインスリン分泌が発揮される。しかしながらその制御メカニズムは未だ不明である。本研究では、その高度な機能制御機構の一つをβ細胞間のギャップ結合が担っていると想定し、膵β細胞におけるギャップ結合を介した情報連絡メカニズムを明らかにする。まず、膵島β細胞間のシグナル伝達を解析するツールとして、本来β細胞に内在していない刺激・応答システムを導入することにより、細胞間伝達シグナルを発信する細胞（A細胞）と受容する細胞（B細胞）をβ細胞株MIN6細胞に遺伝子導入することにより作製した。A細胞の刺激およびB細胞の応答反応はそれぞれ機能的に十分解析可能なレベルであることを確認した。また、A細胞とB細胞を混合培養して擬膵島を作製し細胞間のシグナル伝達を見た検討では、隣接する細胞に効率よくシグナルを伝えるためには、シグナルを発信する細胞、すなわち発火する細胞が、刺激応答する細胞と量的に同程度に存在する必要があることが確認された。β細胞間シグナル伝達のギャップ結合への関与として、A細胞とB細胞にそれぞれコネキシン36ドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞を作製し、混合擬膵島を作製して解析したところ、分泌抑制が認められなかったため、新たなドミナントネガティブ変異体(Cx36-C231S-FLAG)を作製した。このコネキシン36変異体がドミナントネガティブとして機能しているかどうか、ギャップ結合通貨色素分子を細胞内にinjectionしてモニターする方法を立ち上げ、現在検討中である。一方、β細胞の機能のみならず細胞増殖や死についても関与しているかどうか、増殖マーカーや細胞死マーカーをレポーター遺伝子で確認できる細胞も作製中である。
2: おおむね順調に進展している
初年度は、膵島β細胞間のシグナル伝達解析ツールの構築と擬膵島におけるギャップ結合の機能の解明を目的として研究を行った。シグナル伝達解析ツールの構築として、本来β細胞に内在していない刺激・応答システムを導入することにより、細胞間伝達シグナルを発信する細胞（A細胞）と受容する細胞（B細胞）を作製した。また、擬膵島におけるギャップ結合の機能解析としては、A細胞ならびにB細胞へ遺伝子導入したコネキシン36変異体がドミナントネガティブ変異体として機能していなかったことから、今年度は新たなコネキシン36変異体を作製した。その変異体がドミナントネガティブとして機能しているかどうか、分泌機能のみならずギャップ結合通貨色素分子を細胞内にinjectionしてモニターする方法を立ち上げて検討しているところであり、予定よりはやや遅れているものの順調に進められると考えている。また、来年度に行う予定であったβ細胞増殖や細胞死へのギャップ結合の関与についても着手しており、A細胞には増殖を誘導する、あるいは細胞死を誘導するようにし、B細胞にはアポトーシスや細胞死を誘導するERストレス関連マーカー、細胞増殖マーカーの発現をレポーター遺伝子で確認できるように導入している。これらについても順次機能解析を行う予定でおり、全体としては計画はおおむね順調に進んでいるものと考える。
コネキシン36ドミナントネガティブ変異体の作製が確認できた後は、ギャップ結合の通過シグナル分子について、開発したシグナル伝達解析システムを用いて網羅的に探索する。すなわち候補分子をシグナル発信細胞で増加させるため、内在しない受容体やトランスポーターなどをA細胞に遺伝子導入することにより、外因性の増加機構を賦与する。その後B細胞と混合擬膵島を作製し分泌増強をスクリーニングすることにより、ギャップ結合を通過する分子を同定する。一方、β細胞の増殖や死に対するギャップ結合の関与についてもこのシグナル伝達解析システムを用いて検討する。各レポーター遺伝子を導入し、擬膵島を作製して細胞死や増殖因子で刺激することにより、細胞間シグナル伝達が形態学的に関与しているか検討する。また、ギャップ結合の開閉の制御機構について、コネキシン36分子のリン酸化について解析する。分泌機能においてそれらが関与しているかどうかは、ギャップ結合通過色素分子を細胞内にinjectionしてモニターする手法により検討する。また、これらの検討によりギャップ結合の関与を関連分子が明らかにされた際には、それらの遺伝子改変動物を作製し、生体におけるギャップ結合の形態学的ならびに機能学的役割を生理的に明らかにする。ギャップ結合の関与が明らかでない場合は、他の細胞間接着因子等にも視野を広げ、β細胞間の機能および携帯における情報連絡メカニズムについて検討を行う。
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Bioorganic & Medicinal Chemistry
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