| 研究課題/領域番号 |
25461337
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
押田 芳治 名古屋大学, 総合保健体育科学センター, 教授 (10169295)
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| 研究分担者 |
尾崎 信暁 名古屋大学, 総合保健体育科学センター, 特任准教授 (70378082) [辞退]
豊田 行康 名城大学, 薬学部, 准教授 (60103264)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | グルカゴン / Epac / グリコーゲン / 糖代謝 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度、我々は、１）定量PCR法及びウエスタンブロット法を用いて肝臓にEpac2Cが発現すること、２）Rap1のプルダウンアッセイを用いてグルカゴンによってEpacが活性化すること、３）Epacの特異的活性化剤である8-pCPT-2’-O-Me-cAMP（以下ESCA）を用いた実験からEpacの活性化は、初代培養肝細胞におけるグリコーゲンの蓄積を抑制すること、４）グルカゴンの作用をEpac阻害薬ESI-09はキャンセルしないことを明らかにし、グルカゴンによるグリコーゲン抑制作用には、Protein kinase A経路とEpac経路との重複性が示唆された。
本年度は、肝臓の糖代謝におけるEpacの役割を明らかにするために、恒常活性型Epac2Cを発現するアデノウイルス(Ad-Epac2C-CA)を用いてグリコーゲン蓄積に対する効果を初代培養肝細胞を用いて検討することとした。また、in Vivoによる検討を行った。まず、Ad-Epac2C-CAを作製した。初代培養肝細胞にAd-Epac2C-CAを感染させ、CREBのリン酸化を促進しないことを確認した。グリコ-ゲンの蓄積は対照群（Ad-GFP）に比べ、有意な変化はなかった。また、糖新生系酵素であるGlucose-6-phosphatase (G6PC)及びphosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)の遺伝子発現は、Ad-Epac2C-CA群で有意に低下していた。さらに、アデノウイルスを、頸動脈から投与し、恒常活性型Epac2Cを発現させ、対照群（Ad-GFP群）と比較検討した。空腹時血糖値は、両群において有意差はなかった。ブドウ糖負荷試験において、Ad-Epac2C-CA群において血糖値の推移は対照群と同等であった。ピルビン酸負荷試験では、Ad-Epac2C-CA群において有意な血糖低下を認めた。このことは、初代培養肝細胞において、糖新生系酵素の遺伝子発現が低下していたことと一致する結果であった。
これらの結果から、肝臓におけるEpacの活性化は、in vivoにおいて肝糖代謝に寄与する可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
恒常抑制型Epac2Cを発現するアデノウイルスを設計及び作成に時間かかったため、研究計画が少し遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１． ESCAの糖代謝及び脂質代謝関連遺伝子の発現に及ぼす影響を検討する：単離した初代培養肝細胞にESCA処置し、PEPCKやG6PCなどの糖新生系酵素や脂質代謝関連の遺伝子発現を定量PCR法を用いて検討する。
２．Epacの下流シグナルの検討：EpacはRap1を活性化することが知られているが、Rap1の肝糖代謝への役割は明らかではない。また、Epacは小胞体に作用して、細胞内カルシウム濃度を上昇させる。そこで、Epacの下流のシグナルを明らかにするために、まずは、カルシウムシグナルの関与について検討する。カルシウムキレート剤BAPTA-AMやIP3受容体阻害薬であるXestopongin CがESCAによるグリコーゲン抑制をキャンセルするかを検討する。
３．恒常活性型Epac2Cを発現するアデノウイルス(Ad-Epac2C-CA)を用いて、In vivoにおいて肝臓における遺伝子発現を解析する。：アデノウイルスを発現させた肝臓を用いて、糖新生や脂質代謝に関連する遺伝子の発現を解析すると共に、マイクロアレイを用いた遺伝子解析を行う。
４．優位阻害型Epac2Cを発現するアデノウイルス(Ad-Epac2C-DN)を作製する。
作製したアデノウイルスを用いて、以下の実験を行う。１）初代培養肝細胞を用いた実験：優位阻害型Epac2Cアデノウイルスを感染させ、グルカゴン作用について検討する。２）In vivoによる検討：優位阻害型Epac2Cアデノウイルスをマウス頸動脈より投与し、グルカゴンを介した糖代謝、脂質代謝について検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
恒常抑制型Epac2Cを発現するアデノウイルスを設計及び作成に時間かかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
恒常抑制型Epac2Cを発現するアデノウイルスを作製する費用に充てる。
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