| 研究課題/領域番号 |
25461365
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
伴 良行 帝京大学, 医学部, 講師 (00317554)
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| 研究分担者 |
中西 孝子 昭和大学, 医学部, 准教授 (00175499)
植田 俊彦 昭和大学, 医学部, 講師 (20175219)
岩井 信市 昭和大学, 薬学部, 教授 (70317519)
齋藤 雄太 昭和大学, 医学部, 講師 (70407477)
山本 剛 昭和大学, 歯学部, その他 (80384189) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ぺリオスチン / 糖尿病網膜症 / 血管新生 |
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| 研究実績の概要 |
我々は、ヒトより切除された糖尿病網膜症の増殖膜に含まれているタンパク質をLC/MS/MSを用いて網羅的に解析し、ペリオスチンが黄斑前膜と比較して糖尿病網膜症の増殖膜に高く発現していることを世界で初めて報告した。本研究では、ペリオスチンは糖尿病網膜症において血管新生を中心とした病態メカニズムに関連している可能性が高いという仮説のもとペリオスチンの役割を解明する事を目的とする。
動物実験に関しては、平成25年度中に、高酸素負荷網膜症ラット(OIR)と発症に長期飼育（６０週）の必要な糖尿病網膜症(SDT/Jcl)ラットの飼育はすでに完了している。
本年度は、OIRモデルで、ぺリオスチンスプライシングバリアント(SV)の発現を検討する予定であったが、リアルタイムPCRの条件設定が予想外に難航し、安定したデータが得られていない。現在、詳細な条件検討を行っている。さらに、SDT/Jclラット網膜におけるぺリオスチン蛋白の発現を免疫染色にて評価した。方法は、生後各週にラットを屠殺後、眼球を摘出し、右眼を免疫染色用に4%パラホルムアルデヒド/カコジレート緩衝液で２時間固定後、前眼部および硝子体を除去後30%sucrose/PBSに１晩漬け、OCTで凍結保存した。クライオスタットを用いて10μm切片を作製し、スライドグラスに3枚ずつ連続に並べ、免疫染色を実施した。62週において、採取の際に白内障と硝子体混濁を認めた。網膜や脈絡膜ではいずれの週齢でもぺリオスチンの局在についてSDT/Jclラット群とコントロール群に差は認めなかった。
一方、ヒト糖尿病網膜症増殖膜とコントロールとして黄斑上（前）膜を用いて、ぺリオスチンと関連タンパク質の局在と遺伝子発現量を解析する予定であったが、研究代表者の所属の移転及び分担研究者の辞退に伴い、組織の収集が遅れているため、収集が完了次第行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
理由：動物実験に関しては、平成25年度中に、高酸素負荷網膜症ラット(OIR)と発症に長期飼育（６０週）の必要な糖尿病網膜症(SDT/Jcl)ラットの飼育はすでに完了しており、平成26年度以降に実施する予定の実験も平成25年度中に一部前倒しで行っている。ただし、ラット網膜からのｍRNAを用いたリアルタイムPCRでのぺリオスチンスプライシングバリアント(SV)の半定量がうまくいかず、現在、条件を変えて検討している。これはヒト糖尿病網膜症増殖膜とコントロールとしての黄斑上（前）膜に対しても行う予定であり、本研究の重要な実験の一つである。ヒトサンプル（糖尿病網膜症増殖膜と黄斑上（前）膜）を用いた実験に関しては、収集が完了次第、行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究目的に記載したように、高酸素負荷網膜症ラット(OIR)と糖尿病網膜症(SDT/Jcl)ラットを用いた動物実験は、リアルタイムPCRでのぺリオスチンスプライシングバリアント(SV)の半定量以外は、予定通り進行しており、ヒトサンプルからのぺリオスチンと関連タンパク質（TWIST、IL1-β、TNF-α、TGF-β）の局在と遺伝子発現量の解析も、収集が完了次第、実施予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
高酸素負荷網膜症ラット(OIR)と糖尿病網膜症(SDT/Jcl)ラットの網膜組織を用いたウエスタンブロット(WB)、免疫染色(IHC)、RリアルタイムPCRは、予定通り継続してゆく。ヒトサンプルからのタンパク質及び遺伝子発現量の解析も収集が完了次第、実施予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
理由：動物実験に関しては、ウエスタンブロット(WB)、免疫染色(IHC)、リアルタイムPCRに必要な試薬が必要である。ヒトサンプルからのタンパク質及び遺伝子発現量の解析も上記の実験が必要であり、そのための試薬が必要となり、申請時に計画した研究費が必要になると考えられる。
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