| 研究課題/領域番号 |
25461367
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
三柴 裕子 (村瀬 裕子) 大阪医科大学, 医学部, 助教 (80377415)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | グルカゴン / 膵α細胞 / 1型糖尿病 / メタボローム解析 |
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| 研究概要 |
1. インスリンレセプターを安定的にノックダウンした膵α細胞株の作製：マウスのグルカゴノーマ細胞株であるαTC6細胞に、インスリンレセプター遺伝子をターゲットとする5種類のshRNAコンストラクトを導入したレンチウイルスを感染させた。そのうちの1つによって、最大80%のインスリンレセプターのノックダウン効率を有する長期安定細胞株を作製することに成功した。
2. インスリンレセプター安定的ノックダウンα細胞における細胞外グルコース濃度に対するグルカゴン分泌動態の検討：上記で得られたインスリンレセプター安定的ノックダウンαTC6（IRKD）細胞を用いて、グルコース濃度の変化に対するグルカゴン分泌反応の検討を行った。通常の培地で24時間培養後に、Krebs Ringer Buffer（KRB）へ置換し、グルコース濃度を1.5mM、5.6mM、30mMとした。KRB中のグルカゴン濃度をELISA法にて測定し、non-target shRNA導入αTC6（コントロール）細胞と比較検討した。IRKD細胞では、コントロール細胞と比し、低グルコース（1.5mM）下でグルカゴン分泌が低い傾向となり、高グルコース（30mM）下で有意に高いグルカゴン分泌を示した。すなわち、IRKD細胞では、グルコース刺激に対し奇異性のグルカゴン分泌動態を示すことが明らかとなった。
3. インスリンレセプター安定的ノックダウンα細胞における細胞外グルコース濃度に対する細胞内代謝物の検討（メタボローム解析）：IRKD細胞とコントロール細胞のそれぞれを、KRB中のグルコース濃度を1.5mM、5.6mM、30mMの3群に分けて2hr培養し、両細胞のグルコース濃度群別の細胞内代謝物をキャピラリー電気泳動質量分析（CE/MS）にて比較検討した。現在、主成分分析、ヒートマップ解析、パスウエイ解析等で結果を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
交付申請書に記載した予定どおり、平成25年度の1年間で以下の3つの研究項目を計画した。1. インスリンレセプター安定的ノックダウンαTC6（IRKD）細胞株の樹立、2. インスリンレセプター安定的ノックダウンα細胞における細胞外グルコース濃度に対するグルカゴン分泌動態の解明、3. インスリンレセプター安定的ノックダウンα細胞における細胞外グルコース濃度に対する細胞内代謝物のメタボローム解析による検討。平成25年度は予定通り1. ～3. が達成できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在は予定通り、メタボローム解析の結果、インスリンレセプター安定的ノックダウンαTC6（IRKD）細胞においてコントロール細胞と比べて有意に増減する代謝物について検討中である。今後は予定どおり、グルカゴン分泌を刺激もしくは抑制する候補代謝物を抽出し、それらを添加する実験を計画、実施していく予定である。研究計画の変更、問題点は特にない。
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