ｃＰＬＡ２発現抑制による動脈硬化進展抑制効果と新規動脈硬化症治療法開発の試み

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25461374
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 松村 剛 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (20398192)
• 研究分担者: 瀬ノ口 隆文 熊本大学, その他の研究科, 助教 (00530320) ; 本島 寛之 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (40398201)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 脂質代謝異常

研究概要

本年度は、cPLA2α阻害によるPPARγ活性化を介する抗動脈硬化作用発現の有無を見出す目的で、以下の検討を行った。
①mouse cPLA2αの遺伝子配列を参考にしたsiRNA を作製し、そのsiRNAをマウス腹腔マクロファージに遺伝子導入、その後ルシフェラーゼ法を用いてPPARγ活性を測定したところ、コントロールに比しcPLA2α処理細胞では有意なPPARγ活性上昇を認めた。
②上記導入細胞に対し、LPS刺激によるTNF-α、MCP-1発現、無刺激状態でのABCA1、ABCG1発現をmRNAレベルで確認したところ、コントロールに比しcPLA2α処理細胞ではTNF-α、MCP-1発現の有意な減少、ABCA1、ABCG1発現の有意な増加を認めた。
③cPLA2α 欠損マウスの腹腔マクロファージを用い、上記①と同様な検討を行ったところ、コントロールに比しcPLA2α欠損マクロファージでは有意なPPARγ活性上昇を認めた。
④さらに、上記②と同様のLPS刺激によるTNF-α、MCP-1発現、無刺激状態でのABCA1、ABCG1発現をmRNAレベルで確認したところ、コントロールに比しcPLA2α欠損マクロファージではTNF-α、MCP-1発現の有意な減少、ABCA1、ABCG1発現の有意な増加を認めた。
以上より、cPLA2αの負の制御は、PPARγ活性を誘導し、その結果動脈硬化惹起性サイトカインの産生を抑制し、脱泡沫化タンパクを発現誘導することで、抗動脈硬化作用を発揮する可能性が考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

実験計画ではサイトカインの産生やABCA1/G1の産生増強効果はタンパクレベルでの発現検討も行う予定であったが、研究期間の関係で結果は得られていない。ただし、本研究の平成25年度の研究計画である、①cPLA2α分子発現阻害がPPARγの活性を上昇させるのか、②このcPLA2α分子発現阻害がマクロファージにおいて抗動脈硬化的作用を誘導するのか、という検討課題に対し、①については予想に反しない十分満足し得る結果が得られていること、②に関しては、mRNAレベルでの検討では、予想した結果が得られているため、当初の研究目的はおおむね順調に進展していると考える。

今後の研究の推進方策

TNF-α、MCP-1、ABCA1、ABCG1のタンパクレベルでの発現に関しては、本年度まず第一に取り組む予定である。
次に、cPLA2αの分子レベルでの発現抑制マウスを用いた検討として、cPLA2α欠損マウスをapoE欠損マウスと交配させ、cPLA2α欠損/apoE欠損マウスを作成。そのマウス(8週齢)に対し、高コレステロール食付加を6週間施行した後、上下行大動脈の組織を採取。その組織を用いて、
①上下行大動脈の組織を採取し、大動脈を切開・展開したのちにホルマリン固定を行い、Oil-Red-O染色を行うことで粥状動脈硬化巣の進展度をマクロで観察する。②マウス大動脈洞部(大動脈弁上部)を採取ののち同組織の凍結切片を作成し、Oil-Red-O染色を行うことで大動脈洞部での粥状動脈硬化巣の進展度を観察する。③採取した大動脈組織及び作成した大動脈洞部の凍結切片に対し、TNF-α、MCP-1、ABCA1、ABCG1発現量をReal-time RT-PCR法及び免疫組織染色法にて解析する。またマクロファージ特異抗体(F4/80)での免疫染色を同時に行い、上記蛋白の発現局在の確認を行う。④採取した大動脈組織を用い、PPARγの転写活性をコマーシャルベースのELISAキットにて測定する。
以上の検討を予定する。

次年度の研究費の使用計画

本来本年度の実験計画ではサイトカインの産生やABCA1/G1の産生増強効果はタンパクレベルでの発現検討も行う予定であったが、研究期間の関係で実験の遂行が不可能であったため、実験に使用する予定の細胞培養液の費用分を繰り越す必要が生じたため、次年度使用額が生じた。
この次年度使用額は、平成25年度に行えなかったタンパクレベルでの検討時の細胞培養液の購入に充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] The serine protease prostasin regulates hepatic insulin sensitivity by modulating TLR4 signalling. (2014)
  • 著者名/発表者名: Uchimura K, Hayata M, Mizumoto T, Miyasato Y, Kakizoe Y, Morinaga J, Onoue T, Yamazoe R, Ueda M, Adachi M, Miyoshi T, Shiraishi N, Ogawa W, Fukuda K, Kondo T, Matsumura T, Araki E, Tomita K, Kitamura K.
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 5 ページ: 3428
  • DOI: 10.1038/ncomms4428
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluation of a new device for measurement of hemoglobin A1c for Japanese subjects. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shimoda S, Maeda T, Furukawa N, Ichinose K, Taketa K, Igata M, Senokuchi T, Matsumura T, Araki E
  • 雑誌名: Diabetol Int 巻: 4 ページ: 112-116
  • DOI: 10.1007/s13340-013-0141-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Regulation of TNFα converting enzyme activity in visceral adipose tissue of obese mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kawasaki S, Motoshima H, Hanatani S, Takaki Y, Igata M, Tsutsumi A, Matsumura T, Kondo T, Senokuchi T, Ishii N, Kinoshita H, Fukuda K, Kawashima J, Shimoda S, Nishikawa T, Araki E
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 430 ページ: 1189-1194
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.12.086.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Apocynin suppresses the progression of atherosclerosis in apoE-deficient mice by inactivation of macrophages. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita H, Matsumura T, Ishii N, Fukuda K, Senokuchi T, Motoshima H, Kondo T, Taketa K, Kawasaki S, Hanatani S, Takeya M, Nishikawa T, Araki E
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 431 ページ: 124-130
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.01.014.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficacy and safety of sitagliptin as add-on therapy on glycemic control and blood glucose fluctuation in Japanese type 2 diabetes subjects ongoing with multiple daily insulin injections therapy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shimoda S, Iwashita S, Ichimori S, Matsuo Y, Goto R, Maeda T, Matsuo T, Sekigami T, Kawashima J, Kondo T, Matsumura T, Motoshima H, Furukawa N, Nishida K, Araki E
  • 雑誌名: Endocr J 巻: 60 ページ: 1207-1214
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ13-0198
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of combination therapy with vildagliptin and valsartan in a mouse model of type 2 diabetes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyagawa K, Kondo T, Goto R, Matsuyama R, Ono K, Kitano S, Kawasaki S, Igata M, Kawashima J, Matsumura T, Motoshima H, Araki E
  • 雑誌名: Cardiovasc Diabetol 巻: 12: ページ: 160
  • DOI: 10.1186/1475-2840-12-177
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association between circulating leukocyte subtype counts and carotid intima-media thickness in Japanese subjects with type 2 diabetes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Matsumura T, Taketa K, Motoshima H, Senokuchi T, Ishii N, Kinoshita H, Fukuda K, Yamada S, Kukidome D, Kondo T, Hisada A, Katoh T, Shimoda S, Nishikawa T, Araki E
  • 雑誌名: Cardiovasc Diabetol 巻: 12 ページ: 177
  • DOI: 10.1186/1475-2840-12-160
  • 査読あり
• [学会発表] 肥満・メタボリックシンドロームにおける血清脂質値へのコレステロール合成・吸収能の影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 松村剛
  • 学会等名: 第51回日本糖尿病学会九州地方会
  • 発表場所: 沖縄
  • 年月日: 20131108-20131109
• [学会発表] 肥満・メタボリックシンドロームにおける血清脂質値へのコレステロール合成・吸収能の影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 松村剛
  • 学会等名: 第63回日本体質医学会
  • 発表場所: 久留米
  • 年月日: 20131005-20131006
• [学会発表] 肥満・メタボリックシンドロームにおける血清脂質値へのコレステロール合成・吸収能の影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 松村剛
  • 学会等名: 第28回日本糖尿病合併症学会
  • 発表場所: 旭川
  • 年月日: 20130913-20130914
• [学会発表] Therepeutic pproach focused on the inactivation of macrophages for diabetic macroangiopathy. (2013)
  • 著者名/発表者名: 松村剛
  • 学会等名: 第56回日本糖尿病学会年次学術集会
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 20130516-20130518