| 研究課題/領域番号 |
25461387
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
吉田 明雄 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任教授 (90158428)
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| 研究分担者 |
鈴木 幸一 帝京大学, 医療技術学部, 教授 (20206478)
久留 一郎 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60211504)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 甲状腺 / ヨード輸送体 / ペンドリン / バセドウ病 / 橋本病 |
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| 研究実績の概要 |
抗ペンドリン自己抗体のELISAを完成するために様々な方法を試みた。
ペンドリンタンパクにネオルシフェラーゼを付けて行うIｇGとの免疫沈降法。脂溶性のペンドリンをデタージェント存在下でも補足できるようにニッケルプレートによりIgGをプレートに固定してのELISA。などを行ったが、いずれも非特異的な結合が多く、正常IgGと橋本病患者IgGとの結合の差は検出できなかった。デタージェントで溶かした膜タンパクであるペンドリンは、非変性下ではIgGと非特異的に結合してしまい、特異的な結合がどうしても検出できないことがわかった。膜タンパクのELISAはウエスタンブロットと同じ条件でSDS変性したタンパクを用いれば、検出率が上がるとの報告があり、ウエスタンブロットではきれいに検出できることから、同じ条件下でのELISAを行えば、検出ができるのではないかと考えた。この方法だとTritonX0.2%とデタージェント濃度を下げることが可能で、これまでのTSHレセプターなど膜タンパクの結合実験によく用いられた条件であり、測定可能であろうと考えた。そこで、HIStagを付けたペンドリンとHalotagを付けたpenndorinタンパクを合成し、これを、１％SDSで変性してELISAを行うことにした。いずれのタンパクもウエスタンブロットでは、抗HIS抗体、抗Hlotag抗体できれいなバンドが得られるため、両抗体で補足できると確認した。抗HIS抗体、Halotaga抗体をビオチン化し、ビオチンプレートに固定し変性したpendrinを補足した。これにより患者血清、正常血清IgGとの結合をみた。しかし、この方法でも両IgGはPendrinと高い結合を示し、両者の差が得られなかった。人IgGと膜タンパクの非特異的結合をどうやって除き、特異的結合だけを観察するかという課題はどうしても解決できないでいる。
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