| 研究課題/領域番号 |
25461397
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
柴田 洋孝 大分大学, 医学部, 教授 (20245484)
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| 研究分担者 |
伊藤 裕 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40252457)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | アルドステロン / 糖尿病 / ミネラルコルチコイド受容体 |
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| 研究概要 |
１．高グルコースおよびO-GlcNAc修飾とMR発現レベルへの影響
5mMから30mMは培地中グルコース濃度を上昇させた時や、O-GlcNAc transferase (OGT)プラスミドの強制発現を行うと、MRのO-GlcNAc修飾が明らかに増加することが免疫共沈降にて確認された。さらに、MRのO-GlcNAc修飾が増加すると、MR蛋白レベルが増加を認め、O-GlcNAcase (OGA)を強制発現して、MRのO-GlcNAc修飾をキャンセルすると、MR蛋白レベルが著明に減少を認めた。
２.MRのO-GlcNAc修飾残基の同定
MRのO-GlcNAc修飾部位を同定するために、MR(1-670)とMR(671-984)変異体を用いてO-GlcNAcの結合を免疫共沈降法で検討した結果、MR(1-670)のN末端に結合することが示された。次に、MRのN末端をAF-1a(1-170), ID(171-450), AF-1b(451-600)に分割した欠失変異体をFLAGタグとの融合蛋白として発現するプラスミドを作成した。HEK293細胞にこれらの発現プラスミドを強制発現し、FLAG抗体で免疫沈降後に、O-GlcNAc抗体を用いてWesternブロットを施行して、O-GlcNAcとの結合を検討した。その結果、MRのN末端の中で、AF-1a, AF-1bではなく、その中間部分のID(171-450)に結合することが示された。
本結果をふまえて、MRのN末端ID領域(171-450)のO-GlcNAc部位を2014年度に同定していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
高グルコースにおけるMRのO-GlcNAc修飾部位をLC-MS/MSの導入により同定に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
in vitroやほ乳類培養細胞で観察した事象を、個体レベルでマウスを用いて実証していきたい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
2014年6月1日付けで慶應義塾大学から大分大学へ異動があり、研究体制の立ち上げなどの準備期間からただちに研究継続が困難であった。本年度から当初の予定にしたがって、進められる予定である。
2013年度にMRのN末端ID領域がO-GlcNAc修飾を受けることが明らかとなった。本年度は、その領域の組み替え蛋白を精製して、in vitroでO-GlcNAc化反応を起こして、LC-MS/MSにて修飾残基を同定していく予定である。
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