C/EBPβの制御による慢性骨髄性白血病幹細胞の維持機構の解明と治療への応用

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25461415
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 平位 秀世 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50315933)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 転写因子 / C/EBPbeta / 低酸素 / 慢性骨髄性白血病 / 白血病幹細胞

研究概要

慢性骨髄性白血病(Chronic Myeloid Leukemia: CML)の幹細胞の制御機構はCMLの根治、すなわちCML幹細胞の根絶のために解明しなければならない喫緊の課題である。我々は転写因子C/EBPbetaがBCR-ABLのシグナルの下流に位置し、骨髄球系細胞への分化を促進するとともに、CML幹細胞を枯渇させる作用を持つことを明らかにした。しかし、CML幹細胞は生体内で長期にわたり維持されることから、C/EBPbetaの発現や機能を負に制御するような骨髄中の微小環境因子の存在が示唆される。本研究の目的は低酸素環境に着目し、C/EBPbetaの発現および機能を抑制するメカニズムを解明するとともに、その抑制を解除することでC/EBPbetaによるCML幹細胞の枯渇を促進するというCMLの根治に向けたストラテジーを樹立することである。我々は、この目的のためにCML細胞株を低酸素環境下に馴化させた細胞株(hypoxia-adopted: HA株)を樹立した。HA株は通常の酸素分圧で培養する親株と比してC/EBPbetaの蛋白質レベルでの発現が低下していることを見出した。mRNAの低下も伴っていることから、この発現低下は転写レベルで起こっていることが示唆された。我々はC/EBPbetaのプロモーター領域の単離を終えており、この範囲内に低酸素環境下の転写抑制に必要な領域が含まれているかどうかの検討を予定している。また、このC/EBPbetaの低下が、少なくとも試験管内ではインターフェロンや顆粒球コロニー刺激因子、トロンボポイエチンなどそれぞれ単独のサイトカイン刺激によってはは変化しなかったことから、低酸素状態では、急性の刺激によっても解除されないC/EBPbeta抑制機序の存在することが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

低酸素によりC/EBPbetaの発現が負に制御されるという仮説は、用いた二種類の細胞株で示すことができた。また、この変化が酸素分圧の変化により可逆的に変化することも明らかにすることができた。したがって、酸素環境によりC/EBPbetaが負に制御されているという本プロジェクトの仮説は少なくとも部分的には支持することができたと考えられる。その詳細な分子メカニズムを明らかにするために、C/EBPbetaのプロモーター領域の単離は終えているが、低酸素に応答する部分は現時点では当該部位内では検出できていない。また、マウス骨髄細胞へのレトロウイルスによる遺伝子導入と骨髄移植を組み合わせたin vivoの実験は、飼育施設の微生物による汚染問題が生じたために遅延している。

今後の研究の推進方策

低酸素によるC/EBPbetaの負の制御の分子機構をプロモーター解析および遺伝子発現の変化などから検討する。低酸素環境のマスター調整遺伝子として知られる転写因子HIF-1alphaの関与について明らかにするために、レトロウイルスによるshRNAの導入で発現をノックダウンする実験を予定している。またC/EBPbetaの抑制を解除できるようなサイトカインや低分子化合物などについてのスクリーニングを進める。場合によっては複数の因子間の相加・相乗効果についても検討する。予備的な検討から、C/EBPbetaの抑制にはエピジェネティックなメカニズムの関与も示唆されている。この詳細なメカニズムについては、DNAメチル化阻害剤の添加などの実験によって明らかにしていく。またC/EBPbeta抑制の分子メカニズムの解明と並行して、低酸素環境が白血病幹細胞の自己複製能にどのように関わっているか、また低酸素環境下でのC/EBPbetaの誘導によって白血病幹細胞の自己複製能がどのように変化するかをマウス骨髄細胞レトロウイルス感染と骨髄移植を組み合わせた実験系で明らかにすることにより、C/EBPbetaの抑制解除というストラテジーの治療的意義について明らかにする。

次年度の研究費の使用計画

実験動物施設のSPF領域の微生物による複数回の汚染により、マウスの繁殖やマウスを用いた実験の実施が困難であった。そのために骨髄移植を用いるような実験については延期せざるを得なかった。マウスの骨髄移植には、サイトカイン、遺伝子導入試薬、マウス購入・繁殖・維持などに多額の費用が必要であり、今回それらの費用を次年度に持ち越して使用することとなった。
実験施設の汚染問題は解決しており、十分に実施できなかった動物実験が再開可能となっている。C/EBPβノックアウトマウスをはじめとするマウスの繁殖や購入の他、抗体・試薬やプラスチック器具など消耗品の購入に充てる。また成果発表や研究打ち合わせのための旅費も計上する。

研究成果

• [雑誌論文] Genetic correction of HAX1 in induced pluripotent stem cells from a patient with severe congenital neutropenia improves defective granulopoiesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Morishima T, Watanabe K, Niwa A, Hirai H, Saida S, Tanaka T, Kato I, Umeda K, Hiramatsu H, Saito MK, Matsubara K, Adachi S, Kobayashi M, Nakahata T, Heike T
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 99(1) ページ: 19-27
  • DOI: 10.3324/haematol.2013.083873
  • 査読あり
• [雑誌論文] CCAAT/Enhancer-Binding Protein β Expressed by Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Regulates Early B-Cell Lymphopoiesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka S, Miura Y, Yao H, Satake S, Hayashi Y, Tamura A, Hishita T, Ichinohe T, Hirai H, Takaori-Kondo A, Maekawa T
  • 雑誌名: Stem Cells 巻: 32 ページ: 730-740
  • DOI: 10.1002/stem.1555
  • 査読あり
• [雑誌論文] Loss of SMAD4 from colorectal cancer cells promotes CCL15 expression to recruit CCR1+ myeloid cells and facilitate liver metastasis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Itatani Y, Kawada K, Fujishita T, Kakizaki F, Hirai H, Matsumoto T, Iwamoto M, Inamoto S, Hatano E, Hasegawa S, Maekawa T, Uemoto S, Sakai Y, Taketo MM
  • 雑誌名: Gastroenterol ogy 巻: 145(5) ページ: 1064-1075
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2013.07.033
  • 査読あり
• [雑誌論文] Myeloid-derived suppressor cells play crucial roles in the regulation of mouse collagen-induced arthritis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujii W, Ashihara E, Hirai H, Nagahara H, Fujioka K, Murakami K, Seno T, Yamamoto A, Ishino H, Kohno M, Maekawa T, Kawahito Y
  • 雑誌名: J Immunology 巻: 191(3) ページ: 1073-1081
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1203535
  • 査読あり
• [雑誌論文] C/EBPβ promotes BCR-ABL-mediated myeloid expansion and leukemic stem cell exhaustion. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hayashi Y, Hirai H, Kamio N, Yao H, Yoshioka S, Miura Y, Ashihara E, Fujiyama Y, Tenen DG and Maekawa T
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 27(3) ページ: 619-628
  • DOI: 10.1038/leu.2012.258
  • 査読あり
• [雑誌論文] 慢性期CMLと類白血病反応に共通する分子機構 (2013)
  • 著者名/発表者名: 林 嘉宏、平位秀世、前川 平
  • 雑誌名: 血液内科 巻: 67(5) ページ: 638-645
• [雑誌論文] 好中球分化異常と疾患 (2013)
  • 著者名/発表者名: 平位秀世
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 54(10) ページ: 27-38
• [学会発表] 間葉系幹細胞と副甲状腺ホルモンを応用した造血細胞の増幅
  • 著者名/発表者名: 三浦康生、八尾尚幸、吉岡 聡、岩佐磨佐紀、田村彰広、佐藤 淳、横田明日美、平位秀世、一戸辰夫、前川 平
  • 学会等名: 第36回日本造血細胞移植学会総会
  • 発表場所: 沖縄
• [学会発表] Parathyroid hormone enhances expansion through CDH11 in human bone marrow mesenchymal stromal/stem cells.
  • 著者名/発表者名: Yao H, Miura Y, Yoshioka S, Hayashi Y, Yokota A, Tamura A, Ichinohe T, Hirai H and Maekawa T
  • 学会等名: AsiaCORD 2013
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] C/EBPβ in mesenchymal stromal/stem cells regulates early B cell lymphopoiesis.
  • 著者名/発表者名: Yoshioka S, Miura Y, Yao H, Hayashi Y, Tamura A, Hishita T, Ichinohe T, Hirai H, Takaori-Kondo A and Maekawa T
  • 学会等名: AsiaCORD 2013
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] Protective roles of myeloid-derived suppressor cells in autoimmune arthritis murine models through inhibiting pro-inflammatory immune response of CD4+ T cell.
  • 著者名/発表者名: Fujii W, Nagahara H, Kajitani N, Fujioka K, Murakami K, Nakamura K, Seno T, Yamamoto A, Ishino H, Kohno M, Kawahito Y
  • 学会等名: The 57th Annual General Assemble and Scientific Meeting of the Japan Collage of Rheumatology
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] Myeloid-derived suppressor cells have regulatory roles in mouse collagen-induced arthritis.
  • 著者名/発表者名: Fujii W, Ashihara E, Hirai H, Nagahara H, Fujioka K, Murakami K, Seno T, Yamamoto A, Ishino H, Kohno M, Maekawa T, Kawahito Y
  • 学会等名: Annual European Congress of Rheumatology
  • 発表場所: Madrid, Spain
• [学会発表] C/EBPβ expressed by bone marrow mesenchymal stromal cells is indispensable for precursor B-cell lymphopoiesis.
  • 著者名/発表者名: Yoshioka S, Miura Y, Yao H, Iwasa M, Sato A, Tamura A, Yokota A, Hishita T, Ichinohe T, Hirai H, Maekawa T
  • 学会等名: American Society of Hematology, 55th Annual Meeting
  • 発表場所: New Orleans, LA, USA
• [学会発表] Cytokine-STATs signalings upregulate endogenous C/EBPβ in BCR-ABL+ leukemic cells independently from BCR-ABL signaling.
  • 著者名/発表者名: Yokota A, Hirai H, Hayashi Y, Tamura A, Sato A, Yao H, Yoshioka S, Iwasa M, Ashihara E, Miura Y, Maekawa T
  • 学会等名: American Society of Hematology, 55th Annual Meeting
  • 発表場所: New Orleans, LA, USA, December 7, 2013
• [学会発表] Cell-intrinsic and -extrinsic involvement of C/EBPβ in the regulation of hematopoietic stem cells.
  • 著者名/発表者名: Tamura A, Hirai H, Hayashi Y, Yokota A, Sato A, Yao H, Yoshioka S, Iwasa M, Ashihara E, Miura Y, Maekawa T
  • 学会等名: American Society of Hematology, 55th Annual Meeting
  • 発表場所: New Orleans, LA, USA
• [学会発表] Hypoxia-Adapted Myeloma Cells Possess Stem Cell Character.
  • 著者名/発表者名: Ashihara E, Nakagawa Y, Yao H, Yokota A, Miura Y, Takata K, Kitamura Y, Hirai H , Maekawa T
  • 学会等名: American Society of Hematology, 55th Annual Meeting
  • 発表場所: New Orleans, LA, USA
• [学会発表] Direct Interaction with Bone Marrow Mesenchymal Stromal/Stem Cells Is Required for Hematopoietic Expansion by Parathyroid Hormone.
  • 著者名/発表者名: Yao H, Miura Y, Yoshioka S, Iwasa M, Sato A, Tamura A, Yokota A, Ashihara E, Ichinohe T, Hirai H,Maekawa T
  • 学会等名: American Society of Hematology, 55th Annual Meeting
  • 発表場所: New Orleans, LA, USA
• [学会発表] 好中球分化異常と疾患. (教育講演５)
  • 著者名/発表者名: 平位秀世
  • 学会等名: 第75回日本血液学会総会
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 胆汁性肝硬変患者が保有するHLA抗体について
  • 著者名/発表者名: 万木紀美子、平位秀世、菱田理恵、吉澤 淳、吉岡 聡、三浦康生、芦原英司、上本伸二、前川 平
  • 学会等名: 第61回日本輸血・細胞治療学会総会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] 接着法による効率的なさい帯血からの間葉系幹細胞分離に関する検討
  • 著者名/発表者名: 吉岡聡，三浦康生，万木紀美子，平位秀世，東 弥生，高折晃史，前川 平
  • 学会等名: 第61回日本輸血・細胞治療学会総会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] 高頻度抗原に対する不規則抗体および複合抗体陽性の肝臓移植症例への対応 ― 院内および血液センターとの連携の重要性 ―
  • 著者名/発表者名: 万木紀美子、平位秀世、藤本康弘、河村朋子、樋口征昭、丹羽紀美、竹川良子、菱田理恵、三浦康生、辻 肇、上本伸二、前川 平
  • 学会等名: 第61回日本輸血・細胞治療学会総会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] C/EBPbはカンジダ感染後の造血幹細胞・骨髄系前駆細胞の増殖を制御する
  • 著者名/発表者名: 田村彰広、平位秀世、佐竹早紀子、志馬伸朗、佐和貞治
  • 学会等名: 第87回日本感染症学会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] 転写因子C/EBPβは骨髄系分化・増殖の誘導によりCML幹細胞を減少させる
  • 著者名/発表者名: 林 嘉宏、平位秀世、横田明日美、八尾尚幸、三浦康生、芦原英司、前川 平
  • 学会等名: 第17回日本がん分子標的治療学会学術総会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] コラーゲン誘導関節炎におけるMyeloid-derived suppressor cellsは関節炎の制御に重要な役割を果たす
  • 著者名/発表者名: 藤井渉、芦原英司、平位秀世、村上憲、妹尾高宏、山本相浩、石野秀岳、河野正孝、前川平、川人豊
  • 学会等名: 第34回日本炎症・再生医学会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] Proliferation and differentiation of hematopoietic cells by osteogenic-induced bone marrow MSCs.
  • 著者名/発表者名: Yao H, Miura Y, Yoshioka S, Iwasa M, Sato A, Hayashi Y, Tamura A, Yokota A, Ichinohe T, Tohyama K, Hirai H, Maekawa T
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] Involvement of C/EBPβ in the regulation of hematopoietic stem cells.
  • 著者名/発表者名: Tamura A, Hirai H, Hayashi Y, Yokota A, Yao H, Yoshioka S, Sato A, Iwasa M, Ashihara E, Miura Y, and Maekawa T
  • 学会等名: The 75th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 高頻度抗原に対する不規則抗体（抗Jra抗体）の抗体価推移の検討
  • 著者名/発表者名: 万木紀美子、平位秀世、藤本康弘、丹羽紀実、竹川良子、菱田理恵、三浦康生、上本伸二、前川平
  • 学会等名: 第75回日本血液学会総会
  • 発表場所: 札幌
• [学会発表] 骨髄移植症例におけるドナー由来HLA抗体への対応
  • 著者名/発表者名: 万木紀美子、三浦康生、菱田理恵、北脇年雄、錦織桃子、菱澤方勝、近藤忠一、北野俊行、芦原英司、高折晃史、平位秀世、前川平
  • 学会等名: 第100回近畿血液学地方会
  • 発表場所: 大阪
• [学会発表] Myeloid-derived suppressor cells play crucial roles in the regulation of mouse collagen-induced arthritis.
  • 著者名/発表者名: Fujii W, Ashihara E, Hirai H, Fujioka K, Seno T, Ishino H, Kawahito Y
  • 学会等名: Annual Meeting of the Japanease Society for Immunology
  • 発表場所: 千葉
• [備考] 京都大学医学部付属病院・輸血細胞治療部ホームページ
  • URL: http://dtm.kuhp.kyoto-u.ac.jp/