免疫細胞における抗アポトーシス分子アナモルシンの役割の解析

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25461449
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 柴山 浩彦 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60346202)
• 研究分担者: 金倉 譲 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20177489) ; 織谷 健司 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70324762)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: アナモルシン / 炎症 / Bリンパ球 / 鉄・硫黄クラスター / 鉄代謝

研究概要

アナモルシンは、鉄・硫黄（Fe-S）クラスターを形成する分子として、Bリンパ球、マクロファージなどの免疫細胞の機能に関与している可能性がある。また、Picotと結合し、細胞内のシグナル伝達分子の活性化に関与している可能性がある。本研究では、アナモルシン遺伝子改変マウス、主にアナモルシントランスジェニックマウス（AM Tgマウス）を用いて、アナモルシンのBリンパ球、Tリンパ球、マクロファージの機能および細胞内のシグナル伝達への役割を詳細に解析する。さらに、Fe負荷状態でのそれらの細胞の解析も合せて行い、アナモルシンがFeのセンサーとして、免疫細胞の機能調節に関与していることを明らかにすることを目的としている。
平成25年度は、主に、AM Tgマウスの脾臓から単離したBリンパ球をLPSによって刺激した際の細胞増殖およびシグナル伝達分子について検討した。LPSによるBリンパ球の増殖はAM Tgマウスが、WTマウスと比較して低下していた。また、LPSが、Toll like receptor4に結合したあとのシグナル伝達に関与するERK1/2とIκBのリン酸化がAM TgマウスのBリンパ球でWTマウスと比較して低下していた。アナモルシンの作用点を解析する目的で、AM TgマウスとWTマウスの脾臓から単離したBリンパ球をin vitroでLPSによって刺激した際の細胞から抽出したmRNAを用いてDNAマイクロアレイをおこない、遺伝子の発現変化を比較し、変化している遺伝子群からその上流にある分子を解析したところ、AM Tgマウスにおいて、WTマウスと比較してRasの活性が低下していることが示唆された。現在、Ras assayをおこない、AM TgマウスのBリンパ球でのLPSによるRasの活性化を検討している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

アナモルシン過剰発現状態の生物学的意義を検討する目的にて、CAGプロモーターの下流にアナモルシン cDNAをつないだベクターを受精卵にトランスフェクションしたアナモルシントランスジェニック(AM Tg)マウスを作成した。そのマウスのBリンパ球機能を検討するためにマウス腹腔内にLPSを投与したところ、当初はWTマウスと比較してBリンパ球が過剰に増殖反応すると予想したが、結果は逆となり、WTマウスに比べLPSへの反応性が弱いことが判明した。また、Bリンパ球の細胞内シグナル伝達分子の活性化を蛋白のリン酸化を指標に検討したところ、アナモルシン TgマウスのBリンパ球ではLPS刺激の細胞内シグナル伝達に関与するERK1/2やIκBのリン酸化の明らかな減弱を認めた。さらに、アナモルシンの作用点を解明するために、AM TgマウスとWTマウスから単離したBリンパ球をLPSで刺激し、mRNAを抽出してDNAマイクロアレイをおこない、AM TgマウスとWTマウスのBリンパ球における遺伝子の発現変化を比較し、変化している遺伝子群からその上流にある分子を解析したところ、AM Tgマウスにおいて、WTマウスと比較してRasの活性が低下していることが示唆された。現在、Ras assayをおこない、AM TgマウスのBリンパ球でのLPSによるRasの活性化を検討している。以上の研究結果から、これまで不明であったアナモルシンの作用点が初めて明らかとなった可能性がある。

今後の研究の推進方策

（１）AM Tgマウスの免疫能の評価：AM Tgマウスの抗体産生能を指標として、免疫能の評価を行う。
（２）AM TgマウスへのFe負荷モデルにおける免疫細胞の評価：アナモルシンがFe-Sクラスター形成に関係する分子であること、Fe-Sクラスター蛋白の１つであるIRP-1の発現量を調節し、細胞内へのFeの取り込みを制御していること、アナモルシン欠損細胞においては、細胞内に自由Feが多く存在し、さらにROSの蓄積が見られることから、アナモルシンは細胞内のFeの代謝に重要な役割を果たしていることが考えられる。AM TgマウスにFeを負荷し、細胞内のFeの状態に変化を認めるかどうかをBリンパ球、Tリンパ球、マクロファージの細胞内自由FeやROSの量を測定することと、それら免疫細胞の機能を評価することで解析する。
（３）AM Tgマウスにおける炎症状態でのFe動態の評価：炎症状態においては、肝細胞からのヘプシジンの分泌が亢進し、腸管上皮細胞に作用しFeの吸収が阻害されることが知られている。また、細胞内へのFeの取り込みが阻害され、Feの利用障害がおきる。AM TgマウスにLPSを投与し、炎症状態でのヘプシジンの量やFeの動態、赤血球造血を評価し、アナモルシン過剰状態がin vivoでのFe動態に与える影響を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Clinical evaluation of WT1 mRNA expression levels in peripheral blood and bone marrow in patients with myelodysplastic syndromes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ueda Y, Mizutani C, Nannya Y, Kurokawa M, Kobayashi S, Takeuchi J, Tamura H, Ogata K, Dan K, Shibayama H, Kanakura Y, Watanabe M, Emi N, Teramura M, Motoji T, Kida M, Usuki K, Takaku F.
  • 雑誌名: Leuk Lymphoma 巻: 54 ページ: 1450-1458
  • DOI: 10.3109/10428194.2012.745074
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prognosis of core-binding factor acute myeloid leukemia after first relapse. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kurosawa S, Miyawaki S, Yamaguchi T, Kanamori H, Sakura T, Moriuchi Y, Sano F, Kobayashi T, Yasumoto A, Hatanaka K, Yanada M, Nawa Y, Takeuchi J, Nakamura Y, Fujisawa S, Shibayama H, Miura I, Fukuda T.
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 98 ページ: 1523-1531
  • DOI: 10.3324/haematol.2012.078030
  • 査読あり
• [学会発表] Retrospective analysis of 434 symptomatic myeloma cases registered in Kansai Myeloma Forum
  • 著者名/発表者名: 柴山浩彦, 太田健介, 田中宏和, 小原尚恵, 小杉 智, 小林正行, 黒田純也, 金子仁臣, 魚嶋伸彦, 中谷英仁, 通堂 満, 島崎千尋, 高折晃史, 谷脇雅史, 野村昌作, 日野雅之, 松村 到, 金倉 譲
  • 学会等名: 第75回日本血液学会学術集会
  • 発表場所: ロイトン札幌(札幌, 北海道）
• [学会発表] MM治療におけるMRD評価
  • 著者名/発表者名: 柴山浩彦，佐多 弘，金倉 譲
  • 学会等名: 第51回日本癌治療学会学術集会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都）
  • 招待講演
• [学会発表] Retrospective Analysis Of The Recent Treatment Strategies For The Patients With Myeloma-Related Diseases Registered In Kansai Myeloma Forum
  • 著者名/発表者名: Tanaka H, Kosugi S, Ohta K, Shibayama H, Kohara T, Fuchida S, Kobayashi M, Kuroda J, Nakatani E, Nomura S, Taniwaki M, Takaori A, Shimazaki C, Tsudo M, Hino M, Matsumura I, Kanakura Y
  • 学会等名: The American Society of Hematology 55th Annual Meeting
  • 発表場所: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, L.A., USA
• [学会発表] CD7 Expression On Blasts Of Myelodysplastic Syndromes Is Associated With Apoptosis Resistance With Decreased Expression Of The Proapoptotic Protein Bad and An Independent Unfavorable Prognostic Factor Together With The Revised IPSS Score In Patients
  • 著者名/発表者名: Hamada Y, Tamura H, Ishibashi M, Okuyama N, Kondo A, Moriya K, Ogata K, Kakumoto K, Miyazaki Y, Matsuda A, Tohyama K, Ueda Y, Kurokawa M, Shibayama H, Emi N, Mitani K, Naoe T, Sugiyama H, Inokuchi K
  • 学会等名: The American Society of Hematology 55th Annual Meeting
  • 発表場所: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, L.A., USA
• [学会発表] WT-1 Expression Level In BM Is The Great Prognostic Marker In Three Of Classification IPSS, WPSS, and Latest Revised IPSS(IPSS-R)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi S, Ueda Y, Kurokawa M, Ogata K, Shibayama H, Emi N, Usuki K, Ohyashiki K, Ozawa K, Miyazaki Y, Matsuda A, Tohyama K, Mitani K, Naoe T, Sugiyama H
  • 学会等名: The American Society of Hematology 55th Annual Meeting
  • 発表場所: Ernest N. Morial Convention Center, New Orleans, L.A., USA
• [備考] 大阪大学大学院医学系研究科 血液・腫瘍内科ホームページ
  • URL: www.hematology.pro