ドナー由来白血病を含む造血幹細胞移植後の白血病再発に潜在する分子生物学的発症基盤

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25461464
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 長藤 宏司 久留米大学, 医学部, 教授 (60343323)
• 研究分担者: 岡村 孝 久留米大学, 医学部, 教授 (30136436) ; 水野 晋一 九州大学, 先端医療イノベーションセンター, 准教授 (40569430)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 造血幹細胞移植 / 遺伝子解析

研究概要

東海村臨界放射線事故に際しては、放射線性骨髄障害の治療目的で血縁からの同種末梢血幹細胞移植が行われたが、本来正常であったドナー細胞には生着後に新たな染色体異常が認められた。一方、造血幹細胞移植後には、ドナー細胞に由来する白血病の発症が報告されているが、その発症頻度は0.1%から高いものでは5%にまで昇っている。おそらく同種免疫反応の加わる移植後の骨髄環境は、通常の化学療法とは区別されるべき特殊な環境であり、何らかの要因により高率に遺伝子変異を誘導し得る可能性があると考えられる。これは移植医療において看過できない問題であるが、これまでは方法論が十分に確立されていなかったため十分な研究はなされていない。そこで、われわれは移植前後のドナー由来の細胞の遺伝子に注目し、（１）エキソーム・シークエンスによる遺伝子塩基変異の解析、（２）新規開発システムであるゲノム構造解析法によるゲノム構造変化の検出、さらに（３）DNAメチル化解析による遺伝子修飾の比較、を行う。注意すべき点としては、移植後の造血細胞は、様々な割合でドナー/レシピエントのキメラになっており、ドナー由来細胞のみを正確に選別することは困難なことである。そこで、われわれは妊娠歴のない女性への男性からの移植症例を対象とし、Ｙ染色体を指標としてドナー由来細胞を評価することとした。これら包括的な遺伝子解析により、造血幹細胞移植に潜在する、ドナー由来白血病を含む白血病再発の発症基盤の分子生物学的機構を解明する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

造血幹細胞移植に潜在するドナー由来白血病を含む白血病再発の発症基盤の分子生物学的機構を解明するため、移植前後のドナー細胞におけるゲノム変異（主に遺伝子塩基変異）の解析を開始した。移植後の造血細胞は、様々な割合でドナー/レシピエントのキメラになっており、ドナー由来細胞のみを正確に選別することは困難である。そこで、妊娠歴のない女性への男性からの移植症例を対象とし、コロニーアッセイでＹ染色体陽性が得られたコロニー細胞のみをドナー由来と評価し解析に使用することとした。さらに、移植後環境として通常化学療法と異なる特徴のひとつが同種免疫反応であるため、症例の選択においては、GVHD合併症例に焦点を合わせて症例を選択している。
まず造血幹細胞・前駆細胞のコロニーからのエキソーム解析の実験系を確立した。ドナー由来の移植細胞をメチルセルロース培地で培養し、造血幹細胞・前駆細胞からのコロニーを形成し、各コロニーをパスツールピペットで採取した。DNAを抽出後にphi29ポリメラーゼで全ゲノムを均等に増幅した。exon領域をSureSelect Human All Exon V5 (Agilent)により濃縮し、Hiseq1500 (illumine)で遺伝子解析を行い、コロニーからのexome解析の条件設定を行った。同時に、ゲノム構造変化を高精度・高感度に検出するためにメイトペア法を応用した新規システムの開発を行い、その最適化を行った。本システムについてはアダプターの問題から一部にノイズが検出されており、さらなる条件設定が必要である。

今後の研究の推進方策

本研究のための実験法の条件設定および検体保存は適切に進行しており、本年度は造血幹細胞移植前後における造血幹細胞・前駆細胞のコロニーからのexome解析を開始する。さらに遺伝子構造異常の出現の有無について移植後の有核細胞を対象に新規システムによる解析を行う。移植症例については、grade II以上の急性GVHDを発症した症例から検討を始める。一方、慢性炎症ストレスが遺伝子メチル化を含むepigenetic変化につながることが注目されており、本研究課題においてもGVHDに基づく慢性炎症が造血幹細胞に影響を与えている可能性があり、移植前後の造血幹細胞におけるメチル化変化の解析が必要である。そのため本年度は、少量細胞におけるメチル化解析についての条件設定を開始する。また、本課題について介入研究を行うためには動物実験が必要であり、放射線照射に基づくGVHD発症のマウス移植系を作成し、同じくGVHDストレス化での造血幹細胞のゲノムへの影響を動物モデルで検討していく。

研究成果

• [雑誌論文] Expansion of donor-reactive host T cells in primary graft failure after allogeneic hematopoietic SCT following reduced-intensity conditioning. (2014)
  • 著者名/発表者名: Koyama M, Hashimoto D, Nagafuji K, Eto T, Ohno Y, Aoyama K, Iwasaki H, Miyamoto T, Hill GR, Akashi K, Teshima T.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant. 巻: 49 ページ: 110-115
  • DOI: 10.1038/bmt.2013.134.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Donor-derived 47, XXY in an unrelated cord blood transplant recipient. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kawaguchi K, Nakamura T, Nohara M, Koteda S, Nomura K, Morishige S, Oku E, Imamura R, Mouri F, Seki R, Osaki K, Hashiguchi M, Yoshimoto K, Nagafuji K, Okamura T.
  • 雑誌名: Springerplus. 巻: 3 ページ: 72-75
  • DOI: 10.1186/2193-1801-3-72.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Autologous peripheral blood stem cell transplantation with granulocyte colony-stimulating factor combined conditioning regimen as a postremission therapy for acute myelogenous leukemia in first complete remission. (2013)
  • 著者名/発表者名: Eto T, Takase K, Miyamoto T, Ohno Y, Kamimura T, Nagafuji K, Takamatsu Y, Teshima T, Gondo H, Taniguchi S, Akashi K, Harada M.
  • 雑誌名: Int J Hematol. 巻: 98(2) ページ: 186-196
  • DOI: 10.1007/s12185-013-1378-9.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Contribution of bone marrow-derived hematopoietic stem/progenitor cells to the generation of donor-marker⁺ cardiomyocytes in vivo. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fukata M, Ishikawa F, Najima Y, Yamauchi T, Saito Y, Takenaka K, Miyawaki K, Shimazu H, Shimoda K, Kanemaru T, Nakamura K, Odashiro K, Nagafuji K, Harada M, Akashi K.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8(5) ページ: e62506
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0062506.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Monitoring of minimal residual disease (MRD) is useful to predict prognosis of adult patients with Ph-negative ALL: results of a prospective study (ALL MRD2002 Study). (2013)
  • 著者名/発表者名: Nagafuji K, Miyamoto T, Eto T, Kamimura T, Taniguchi S, Okamura T, Ohtsuka E, Yoshida T, Higuchi M, Yoshimoto G, Fujisaki T, Abe Y, Takamatsu Y, Yokota S, Akashi K, Harada M.
  • 雑誌名: J Hematol Oncol. 巻: 6 ページ: 6-14
  • DOI: 10.1186/1756-8722-6-14.
  • 査読あり