研究課題
基盤研究(C)
本研究においては、組織に特異的に発現する抗原と制御性T細胞など免疫抑制性の作用を持つT細胞をin vivoにおいて効率よく誘導することが必要である。前者の組織に特異的に発現する抗原を検索するためにマウスの正常組織のマイクロアレイのデータを用いて解析を行った。今回は、CD4+Th 細胞が主たる病因であるマウスモデルとして実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を用いるため、脳脊髄の組織に発現量が高く、そのほかの組織に比較的発現が少ない遺伝子を選定している。現在、この遺伝子のメッセンジャーRNA の発現をRT-PCR で確認を予定している。有意なものについてはタンパク質レベルで発現をWestern blot で確認する。後者の抑制機能を有したT細胞を効率よく誘導する機能性たんぱく質としてはこれまでの研究からTRAILとIL-10が候補となると考えている。遺伝子導入には、PuromycinやNeomycinの耐性遺伝子を選別用マーカーとして組み込んだ発現ベクターを準備した。この発現ベクターが機能するかを確認するために、コントロールとなる遺伝子を用いて、電気穿孔法で遺伝子導入し、それぞれの耐性遺伝子で選別を行い、コントロールの遺伝子が発現していることをRNAレベル、タンパク質レベルで確認することができた。そのうえで、マウスIL-10、マウスTRAILの遺伝子については発現ベクターを作製して、transient transfectionで発現を確認ののち、マウスES細胞に電気穿孔法で遺伝子導入し、高濃度の薬剤選別のうえ、クローニングを行い、高発現体の準備ができている。
2: おおむね順調に進展している
マクロアレイのデータの解析、遺伝子導入、高発現体の選別の系を安定して作動させることができ、本研究の中心となる実験系を立ち上げることができた。さらに安定して機能できることを確認することができ、おおむね良好の進捗状況と考えている。
今後は、組織特異的な抗原遺伝子を特定し、これを発現ベクターに組み替えて、マウス多能性幹細胞、あるいは抗原提示細胞の細胞株に電気穿孔法で遺伝子導入する予定である。これを用いて、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）などの動物モデルにおける効果を確認することを予定している。
使い残していた試薬の使用や、試薬・消耗品などの無駄のない使用により、費用が予定よりも少なく、次年度への繰り越しとなった。次年度の研究予定に組み入れて使用予定である。
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