| 研究課題/領域番号 |
25461510
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
田中 淳 大阪大学, 微生物病研究所, 特任講師(常勤) (20321953)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | チクングニアウイルス |
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| 研究実績の概要 |
CHIKV感染性評価系として、CHIKV膜蛋白質を持つ組み換え牛水疱性口炎シュードタイプウイルスを作製しその感染性について検討した。CHIKV膜蛋白質遺伝子発現プラスミドをトランスフェクトした293T細胞にGFP(もしくはLuciferase)遺伝子発現組み換え牛水疱性口炎ウイルスを接種することで、CHIKV膜蛋白質を持つ組み換え牛水疱性口炎ウイルスの作製を試みた。これらのシュードタイプウイルスの感染性は接種18時間後あたりから明瞭に検出が可能であり、その感染力価は107 IU/ml以上であった。
CHIKV膜蛋白質を持つシュードタイプウイルスを用い検討した種々の培養細胞において、ヒトアストロサイト－マ由来U251MG細胞が最もCHIKVに感受性が高かった。このU251MG細胞から調整したcDNAライブラリーを発現するレトロウイルスベクターを、元のU251MG細胞に導入することで、mRNA発現形態が元のU251MG細胞とは異なる細胞ライブラリー、U251MG/cDNAを構築した。
CHIKVの感染増殖に関与する細胞性因子の同定のため、これらの細胞ライブラリーにCHIKVを接種し生き残ってくる細胞の分離と、導入されているcDNAの同定を試みた。今回得られた生存細胞株は全てCHIKV感受性を有していたが、うち８クローンではウイルス接種後の細胞生存性が親株のU251MG細胞の２倍以上となっており、またこれらのクローンのうち２クローンで感染感受性の減少が観察された。これらCHIKV低感受性細胞クローンに導入されていたレトロウイルスベクターには、細胞骨格関連、G蛋白質関連、ミトコンドリア関連、リボゾーム関連などのcDNAがコードされていた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
チクングニアウイルス感染感受性の低下した細胞株、チクングニアウイルス感染後の細胞死に対する抵抗性が亢進した細胞クローンを得ることができた。今後はこれらの細胞クローンへ導入されたcDNAのコードしていた遺伝子、レトロウイルスベクター挿入位置の遺伝子のCHIKV感染動態への関与についての解析を進める必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回得られた細胞クローンはチクングニアウイルス感染に対して完全な抵抗性ではなく、低感受性である。今回の実験で使用した細胞株は染色体が2nの2倍体であるため、レトロウイルスベクターでのノックアウトは完全なものにはなっていないと考えられる。今後は染色体がｎのハプロイド（1倍体）型の細胞を用いて実験を行い、チクングニアウイルス感染に完全な抵抗性を示す細胞の分離を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験の進捗状況に応じて消費期限のある試薬等の購入を見合わせたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
昨年度購入を見合わせた各種抗体等を購入する予定。
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