| 研究課題/領域番号 |
25461525
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
竹村 弘 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (80301597)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | カルバペネム薬 / 抗菌薬 / A549細胞 / 培養細胞 / 失活 |
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| 研究実績の概要 |
平成25年度は、主にカルバペネム薬失活効果の評価系を、より簡便で安定したものにすることに重点を置き、主にA549細胞を用いて、細胞を無血清RPMI1640培地で培養した際の培養上清液のカルバペネム薬失活効果を測定する系を確立した。平成26年度は、この結果を受けて、カルバペネム薬失活活性を有した細胞上清を20-40mL程度集めて、凍結乾燥することで10倍程度に濃縮し、検体中の代謝産物の質量分析による解析（CE-TOFMS、LC-TOFMS）を外注検査（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社）で行った。対象と比較して、カルバペネム薬失活活性を有した細胞上清検体に有意に多い物質を絞り込み、その中でも17種類の候補物質を選択してカルバペネム薬失活活性の有無を調べるスクリーニング検査を行った。カルバペネム薬失活活性の有無を調べるスクリーニング検査は、検体にカルバペネム薬（IPM）を添加して96穴のマイクロプレート上でMicrococcus luteusの発育の有無を確認する系で、新たに確立した方法である。すなわち各々の検体の希釈系列に対して、MICの2倍濃度のIPMと反応させた後M. luteusを接種し、24時間培養後に菌の発育を目視で判定した。この結果、L-cysteine を12.5µg/mL（71µM ）以上含むウェルでM. luteusの発育を認め、A549細胞培養上清のカルバペネム薬失活活性の原因の一つがL-cysteineであることが示唆された。その後、5,5′-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid（DTNB）を用いたEllman法でA549細胞の培養上清中に、培養開始後数時間程度でL-cysteineが放出され、その挙動と培養上清のカルバペネム薬失活活性は一致しており、この活性はL-cysteine単独によるものであることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、様々なヒト由来の培養細胞をある条件で培養すると細胞培養液中の抗菌薬（カルバペネム薬）が失活する現象のメカニズムの解明を、当面の主な目的としてきた。上記のように、この現象の原因物質の探索という点では、今年度は大きな成果を得ることができた。このため達成度としては、(2) のカテゴリーとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年までの研究で、特定の条件で培養した細胞培養液の上清中ではカルバペネム薬が失活すること及び、この現象の大まかな挙動が明確になり、そのメカニズムとして培養細胞によるL-cysteineの産生、放出が想定できた。今後は、L-cysteineによるカルバペネム薬の失活活性の詳細を分析するとともに、細胞種や抗菌薬を変えて、その実態を検討し、さらにL-cysteineによるカルバペネム薬が失活活性に影響を与える因子、（条件や物質）の解明をめざしたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年までの研究で、特定の条件で培養したヒト細胞培養液の上清中ではカルバペネム薬が失活する現象の大まかな挙動が明確になり、そのメカニズムとして細胞由来のL-cysteineによりカルバペネム薬が失活することが判った。当初、この失活メカニズムの解明及び原因物質の特定は難航し、外注検査を含めて研究費用がかさむと考えられていたが、考えていたよりも順調に特定でき、活性の挙動を解析する実験系も既存の方法で、比較的安価で行えているため今年度の研究費が予定よりも少なくて済んだ。また今年度は、研究成果を学術論文にまとめたり、国際的な学術雑誌、学会等で発表したりする機会も無かったため、来年度以降に研究費を繰り越して使用したいと考えている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ヒト培養細胞由来のL-cysteineによってカルバペネム薬が失活することを踏まえて、より多くの細胞、抗菌薬で同様の現象がみられないかを検討する。また、L-cysteineによるカルバペネム薬失活効果を、HPLCを用いてより詳細に解析する予定である。このため新たに細胞、抗菌薬、HPLCカラムなどの高額の器材の購入する予定である。さらに研究の総括として、国際的な学会及び誌上で成果を発表できるように準備したいと考えている。
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