| 研究課題/領域番号 |
25461527
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
福富 康夫 国立感染症研究所, その他部局等, 室長 (30189956)
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| 研究分担者 |
星野 仁彦 国立感染症研究所, その他部局等, その他 (20569694)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 抗酸菌 / マクロファージ / NOX（phox） / 抗菌活性 / 蛍光色素 |
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| 研究概要 |
本研究では抗酸菌感染症における宿主の殺菌機構の分子生物学的解明を、主としてNADPHオキシダーゼ(Nox)を介したシステムを中心として行うことを目的としている。初年度（25年度）は宿主マクロファージ内にて増殖する細胞内寄生菌である抗酸菌に対する殺菌現象を細胞レベルで可視化することを試みた。
最初に、ヒトやマウスマクロファージを8ウェルチェンバースライド、もしくはカバースリップ内で培養して張り付かせた。そして、非結核性抗酸菌やハンセン病の起因菌であるらい菌を感染させメタノールで迅速処理した後、oregon green もしくはauramineを添加して菌を緑色蛍光標識した。さらに、cyano-tetrazolium chloride (CTC)を添加し数時間培養した。CTCは生菌の呼吸代謝によりCTFとなって赤色蛍光を発するCTFとなることからCTFを持っている菌は生菌として評価できることが判明している。このように二種の蛍光色素で標識された試料スライドを共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。その結果、マクロファージを活性化することが知られているサイトカインのひとつであるIFNγで刺激を受けたマクロファージ中の抗酸菌（緑色蛍光部分）の赤色蛍光が減弱していることが判明した。さらに抗phox抗体を用いNox関連タンパク質を別の蛍光色素で染色して多重染色を施した試料を観察したところ、phoxの集積量が多いほど菌の赤色蛍光が減弱しており菌がダメージを受けていることが分かった。一方、対照マクロファージではphoxの発現量は低く菌周囲へのphoxタンパクの集積も少なかった。従ってIFNγにより誘導されたマクロファージの抗菌システムにおいては、活性酸素を産生するNADPHオキシダーゼ(phoxタンパク)の発現が増強して、菌周囲へ集積することが必要な条件であることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
以前からサイトカインのひとつであるIFNγにて刺激を受けた培養マクロファージの抗酸菌に対する抗菌活性発現の増強は認められている。一般的にマクロファージ内の生菌数は、感染細胞を可溶化して固形培地に塗布し培養して得られるコロニー数から判定される。一方、生菌による代謝反応により、基質であるCTC色素分子が蛍光を発するCTFに代謝されその発色強度を比較するのも有用な生菌数評価方法であることが分かった。しかも抗酸菌は増殖速度が遅く、菌を細胞から回収して固形培地上で培養を開始するとコロニーが目視できるようになるまで数週間もかかる。それと比較すると蛍光色素発色のための培養と共焦点レーザー顕微鏡による画像解析は蛍光色素を加えてから一日以内で結果が得られるというメリットがある。但し、得られた画像の蛍光強度定量化の部分で改良の余地があるので方法論の確立の観点からは当初の計画より若干の遅れを生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はまず、多重染色試料を共焦点レーザー顕微鏡で観察して得られた画像の各種蛍光の強度定量化確立を第一目標とする。多重染色になると二重染色以上に染色法の改良も必要となる。殺菌にかかわる分子として着目している活性酸素(ROS)や酸化窒素（NO）について、ROSを供給する主要な機構はNADPHオキシダーゼ（Nox）が担っている。Noxの中でNox2による殺菌機構は比較的解明が進んでいる。Nox2による活性化には、ファゴゾーム膜上のgp91phoxとp22phoxに、細胞質由来のp40phox、p47phoxが会合することが必要であるといわれているが、それを本研究計画のシステムで精査し抗酸菌感染でも同様な機構が働いているか証明する。われわれの観察結果ではヒトマクロファージのIFNγ刺激でこれらphoxタンパクが細胞内で著明に増加し、さらに抗酸菌を含むファゴゾーム周囲に集積することが判明した。このことはphoxタンパクのサブユニットが複合体を形成し活性型になっている可能性を示唆している。CTCは代謝活性を有する生菌により還元反応を受けると蛍光を発するので、細胞内に存在する菌の生死判別に用いることができる。本研究ではIFNγで刺激したヒトマクロファージ中の抗酸菌の代謝活性が低下していることから、抗菌システムが働いていることが示唆された。今後、phoxの細胞内局在と菌のCTC還元反応による蛍光分子生成を共焦点レーザー顕微鏡で詳細に調べることで、NOXの殺菌作用への関わりがより詳細に解明できると思われる。そして、本研究計画の次のステップ、すなわちノックアウトマウスを使った研究に進むことができる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
予想よりも消耗品代が少なかった。
本年度は予想より消耗品代が増加することが予想される
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