| 研究課題/領域番号 |
25461527
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
福富 康夫 国立感染症研究所, その他部局等, その他 (30189956)
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| 研究分担者 |
星野 仁彦 国立感染症研究所, その他部局等, その他 (20569694)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 抗酸菌 / マクロファージ / NOX（phox） / 抗菌活性 / 蛍光色素 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では抗酸菌感染症における宿主の殺菌機構の分子生物学的解明を行うことを目的としている。抗酸菌はマクロファージを中心とした貪食系細胞に寄生して増殖する細胞内寄生菌である。宿主側はそのような細胞内寄生菌に対し細胞内に保有する殺菌関連因子を用いて殺菌、若しくは増殖抑制を行って抵抗する。このような殺菌因子の中には、通常リソソームに含まれる酵素があり、ファゴゾーム内に含まれている細胞内寄生菌に対しリソソームを融合させることにより殺菌を試みる。このような殺菌機構の他、マクロファージは酸化窒素や酸素ラジカルを用いて殺菌作用を高める機構をも持ち合わせている。一般的にマクロファージは、IFNγといったT細胞と呼ばれれる他の免疫集団が産生するサイトカインによって刺激を受けて活性化して殺菌力を高める。よって、本研究では上述の殺菌機構を可視化して解析することを試みており、IFNγ刺激を受けて活性化したマクロファージにおいて、酸素ラジカル産生を高めるNADPHオキシダーゼ（NOX）タンパク複合体が抗酸菌周囲に集積する現象を見出した。方法論としてはin vitroで非結核性抗酸菌やハンセン病の起因菌であるらい菌を感染させて培養したヒト末梢血単球由来マクロファージをメタノールで迅速固定したのち、菌を蛍光色素で標識し、さらに、生菌により代謝を受けると別波長の蛍光を発する色素と共培養し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果、生菌の減少（蛍光色素発色量減少）とNOX酵素タンパクの菌周囲への集積増大が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまで、IFNγは細胞性免疫を増強させる代表的なサイトカインとして知られてきた。このサイトカインにはマクロファージを活性化させ抗菌活性を増強させる作用があることが分っている。マクロファージの抗菌活性は、マクロファージと菌の混合培養から回収された試料中の生菌量を調べることで測定できる。また、特殊な方法として、培養不能ならい菌の場合、感染したマクロファージかららい菌を回収し放射性同位元素で標識した基質の代謝活性を測定することで菌の生死を評価できる。但し、放射性同位元素を扱うという観点からRI取扱施設が必要であり簡便な方法とは言えない。そ子で、種々の方法を比較検討したところ、生菌による代謝反応によってある種の色素分子は基質として作用し、蛍光を発するようになり、その発色強度を比較す方法が有用であり定量化も可能であることが判明した。しかも、抗酸菌は増殖速度が他の菌と比べて遅い為、菌を細胞から回収して固形培地にまき培養開始、その後、コロニーにより菌数が把握できるまで数週間を要する。それに比べると、蛍光色素発色のために必要となる培養時間とそれに続く共焦点レーーザー顕微鏡による画像解析は蛍光色素を加えてから一日以内で結果が得られるという時間的なメリット大である。但し、蛍光色素の発色強度を定量化するための画像解析方法の確立が求められる。これまで得られた膨大な量の写真データをいかに迅速かつ正確に解析できるかが本研究のポイントとなると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ハンセン病の起因菌であるらい菌は抗酸菌の一種であるが、未だに人工培養が成功していない。幸いにも動物接種による増菌手法は確立されており、viabilityの高いらい菌はヌードマウス足しょに接種して増殖してきた菌を精製して得ることができる。らい菌の生死判定方法としては生菌が保有する脂質代謝（β酸化経路）をみるradiorespirometryがある。これまで、我々はマクロファージの抗らい菌活性をこの方法で調べてきた。一方、近年、蛍光色素を用いた研究手法が増えている。
我々は、CTCと呼ばれる分子が生菌により還元されて蛍光を発するCTFに変化する代謝反応に着目し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて培養マクロファージ内らい菌の生存状態を調べた。その結果、マクロファージの活性化レベルと比例してらい菌の代謝活性が減弱することが分かった。また、抗らい菌薬を培地に添加した場合も同様にマクロファージ内らい菌の代謝活性は減弱した。これらの「減弱」は蛍光色素の発光量を顕微鏡写真より定性的に捕えることで判定してきたが、画像処理解析ソフトを用いることで発光量の定量化が可能であることが判った。すなわち、マクロファージの殺菌活性がradiorespirometryと同様な形で数値化できるということを意味し、培養できないらい菌の研究において利用価値の非常に高い方法であるということが示された。当然、培養可能な抗酸菌においても有用な方法である。
今後は、試料の多重染色法に改良を加え、共焦点レーザー顕微鏡による観察に適した試料染色法を確立する。抗酸菌がすべて染色される条件下で、生菌のみが基質である蛍光色素を代謝し発色しなければならない。そして、殺菌に関わる細胞内因子（分子）の菌周囲への集積を調べる。例えばNADPHオキシダーゼ複合体タンパクやROS、また、殺菌に関わる活性酸素を除去するカタラーゼなど。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末納品等にかかる支払いが平成28年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。また、本補助事業の目的をより精緻に達成する為に、蛍光顕微鏡試料の追加作成、並びに追加観察を行っていたところ、論文の投稿が遅れ２７年度内の投稿ができなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
学会発表と論文投稿代。
追加実験のための試薬購入。
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