| 研究課題/領域番号 |
25461557
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| 研究機関 | 茨城県立医療大学 |
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研究代表者 |
中山 純子 茨城県立医療大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (30433155)
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| 研究分担者 |
有波 忠雄 筑波大学, 医学医療系, 教授 (10212648) [辞退]
岩崎 信明 茨城県立医療大学, 保健医療学部, 教授 (70251006)
野口 恵美子 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40344882)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 熱性けいれん / 遺伝子 / MLPA法 |
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| 研究実績の概要 |
血縁関係のない日本人熱性けいれん患者48名を対象として遺伝子解析を行った。候補遺伝子としては、「5q14.3-q15微小欠失症候群」の欠失領域からてんかんの候補遺伝子と考えられているMEF2C遺伝子（Mads box transcription enhancer factor 2, polypeptide C）とGPR98遺伝子（G protein-coupled receptor 98）を対象とした。
これらの遺伝子については、前年度にダイレクトシークエンス法により遺伝子変異検索を行ったが疾患と関係すると考えられる遺伝子変異は同定されなかったため、今年度はダイレクトシークエンス法では検出することができない遺伝子内の微小欠失や微小重複などの異常を検出する目的で、MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)法により解析を行った。患者DNAを熱変性させ、SALSA MLPA kit (FALCO biosystems)を用いて、MEF2C遺伝子の全エクソン領域についてハイブリダイゼーション反応およびライゲーション反応を行い、PCR増幅後にABI PRISM 3100 DNA Sequencerを用いて電気泳動を行った。得られたデータをCoffalyser.Netプログラムで解析し、各エクソンのコピー数を検討したところ、1名の患者において、エクソン１の重複が同定された。同定された遺伝子重複についてDatabase of Genomic Variantsで確認したところ、すでに報告のある遺伝子多型であった。GPR98遺伝子についても同様の方法でエクソン7のコピー数を検討したが、全患者で異常は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成26年度は当初の予定どおりMEF2C遺伝子の全エクソンについてMLPA解析を終了することができた。またGPR98遺伝子についてもMLPA解析を行うことができたが、解析できた領域はごく一部であるため、次年度も引き続きGPR98遺伝子のMLPA解析を継続する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度に行ったMLPA法による遺伝子変異解析では、MEF2C遺伝子については全エクソン領域について解析が終了したが、熱性けいれんに特異的と考えられる遺伝子変異は同定されなかった。そのため、平成27年度はGPR98遺伝子について引き続きMLPA解析を行い、遺伝子内の微小欠失や重複などの異常を検出することを目標とする。
解析の対象は血縁関係のない日本人熱性けいれん患者24名とする。GPR98遺伝子の塩基配列をデータベースから入手し、MLPA Designerなどのソフトウェアを用いてMLPA用プローブを作成する。次に患者DNAを熱変性させ、プローブを添加しハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応を行う。その後PCR増幅を行い、ABI Prism 3100 sequencerで電気泳動を行い、目的領域の欠失や重複などのコピー数異常の有無を検討する。GPR98遺伝子は既知の膜蛋白の中でも最大の蛋白で非常に大きな遺伝子であるため、解析対象は全エクソンではなく、重要なドメイン部分を中心に行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度の実験では、MLPA解析において一部市販のキットを利用することができたため、当初の予定よりも試薬代が低額となった。次年度の解析では市販のキットを利用することができないため、プローブ設計用のソフトウェアやプローブ作成のための支出が大きくなるため、平成26年度分の研究費を次年度に繰り越して使用することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額については、おもにMLPA法によるGPR98遺伝子の変異解析のための試薬等の購入に使用する予定である。
具体的には、MLPAプローブ設計用ソフトウェア、MLPAプローブ合成費用、SALSA MLPA試薬(FALCO biosystems), シークエンス用試薬(Applied biosystems)などを購入する予定である。
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