| 研究課題/領域番号 |
25461565
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| 研究機関 | 鈴鹿医療科学大学 |
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研究代表者 |
古川 絢子 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助手 (10455537)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 酸化ストレス / プロテオミクス / 興奮毒性 / 神経細胞死 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は脳内環境の恒常性を維持する役割を果たすグリア細胞に注目し、興奮毒性による神経細胞死を制御するメカニズムを解明する事が目的である。グリア細胞が興奮毒性時に応答する際、どのような分子が関わるかを明らかにし、その正常化を目指す事で神経細胞保護的な環境を作り出す事を目標に行っている。本年度は、興奮毒性における酸化ストレスを中心に、グルタチオン（GSH）産生および細胞内酸化損傷タンパク質の検出を行った。
C6ラットグリオーマ細胞を用いて、興奮毒性が引き起こす酸化ストレス状態を評価した。また、タンパク質酸化損傷の指標としてカルボニル化タンパク質の生成を検出し、興奮毒性による酸化ストレスの経時的変化と合わせて定量解析した。興奮毒性試薬としてグルタミン酸を負荷したC6細胞は、時間依存的に細胞死が認められた。この時の細胞内GSH量は、細胞死が認められるよりも早期から減少していた。このことは、グルタミン酸による細胞死に先立ち、細胞内が酸化ストレス状態であることを示している。GSHの減少に伴いタンパク質の酸化が認められるかについて、カルボニル化タンパク質を定量することで評価した。グルタミン酸負荷した細胞から経時的にタンパク質を抽出し、カルボニル化タンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果、GSH減少にやや遅れてカルボニル化タンパク質が増加する傾向が認められた。さらに個々のタンパク質のカルボニル化量を比較する目的で、二次元電気泳動とウェスタンブロットを組み合わせた実験を行った。その結果、コントロールと比較して著しくカルボニル化が増加するタンパク質の存在が認められた。酸化ストレスに脆弱なタンパク質が存在することは、細胞内の特定の機能が酸化ストレスにより影響を受ける事を示唆すると考える。今後はタンパク質の同定を行い、どのような機能が影響を受けるかを明らかにしてゆきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、興奮毒性負荷後のアストロサイトにおける細胞内酸化ストレス状態の詳細を検討し、細胞内酸化ストレスが生体高分子に与える酸化損傷を解析した。興奮毒性試薬を負荷したC6ラットグリオーマ細胞では、GSHの減少を介して細胞内が酸化ストレス状態となり、タンパク質の酸化損傷の指標であるカルボニル化タンパク質が増加する事を明らかにした。さらにこのタンパク質酸化損傷は、特定のタンパク質において強く認められた。これらの結果は、興奮毒性状態で生じた酸化ストレスがタンパク質を酸化し、細胞の生存に影響を与えていると考えられる。今後、どのような機能を持つタンパク質が酸化ストレスに対して脆弱であるかを明らかにすることで、興奮毒性におけるグリア細胞に対する酸化ストレスの役割が解明できると考える。
本年度の結果から、興奮毒性試薬負荷によってグリア細胞が酸化ストレス状態になる事が明らかになった。我々は以前、興奮毒性試薬を投与した実験動物において、転写因子Nrf2によって発現が制御されている抗酸化酵素ヘムオキシゲナーゼ１が強く発現する事を認めている。本実験系においても、転写因子Nrf2が制御する遺伝子の変化を検討することで、GSH減少による酸化ストレスがグリア細胞の応答にどのような影響を与えるかを解明できると考える。以上のように次年度の検討課題は明らかになっており、概ね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は興奮毒性を負荷したグリア細胞において酸化損傷を受けるタンパク質を同定する。どのような機能を持つタンパク質が酸化ストレスの標的となるかを明らかにし、グリア細胞の機能変化や細胞死との関わりを検討する。また、酸化ストレスに応答する転写因子であるNrf2の下流遺伝子の発現変動について、グリア細胞における詳細な解析を行う。Nrf2をノックダウンした状態と比較し、酸化ストレスに対するグリア細胞自身の細胞死抑制効果を検討する。神経細胞に対して与える影響についても、培養上清や共培養系を用いて検討する。グリア細胞が酸化ストレスに対して応答することで神経細胞にどのような影響を及ぼすかを解析し、グリア細胞が作る脳内環境を神経細胞保護的にするための鍵となる分子を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度の繰越しがやや多かった事と、今年度の試薬や消耗品の購入価格が予定より抑えられたために若干の差額が生じたが、概ね予定通りの支出であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の英文校正および論文投稿に必要な費用として計上する。
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