| 研究課題/領域番号 |
25461581
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
今井 千速 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (90419284)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | NK cell / chimeric receptor / Trogocytosis / KIR haplotype |
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| 研究概要 |
【１】 健常者における刺激型NK細胞受容体群の遺伝的プロファイルとNK細胞機能解析
数十人の健常者から書面による同意と自発的協力を得て末梢血を採取した。解析は以下のように進めた。①KIRタイピングキットを用いてKIR genotypingを行う。その結果から、KIR haplotype AあるいはB、centromeric A/A, A/B or B/B、telomeric A/A, A/B or B/BおよびB content scoreを判定した。②NK細胞受容体群のなかで活性化受容体として最も重要とされるNKG2Dの遺伝子多型をTaqman PCRで判定した。③NK細胞における測定可能な受容体群の発現レベルをフローサイトメトリーにより調べた。④殺傷能（細胞障害活性）に関して CD107a mobilization assayで評価した。⑤活性化マーカーCD69, CD25の発現解析を行った。⑥K562-mb15-41BBLとの共培養によるNK細胞の体外増幅率を測定した。
次年度にはサイトカイン産生の定量を行う予定である。また測定人数の増加を目指したい。
【２】 Trogocytosis-based CAR transfer：donor-cell lineの作製とキメラ型受容体Transferの予備実験
現在のところ、まずはK562（Original）にCAR遺伝子およびコントロール遺伝子を導入し、2種類のBulk株からLimiting dilution methodによりそれぞれクローン化を行い、高発現株をいくつか得ることが出来た。現在Trogocytosisについて検証中である。また次年度には、上記の通り、NK細胞のFeeder cell lineであるK562-mb15-41BBL細胞をベースにした新たなDonor cell lineを作製する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画書に記載した内容に、わずかに遅れた形で進んでいる。
【１】健常者における刺激型NK細胞受容体群の遺伝的プロファイルとNK細胞機能解析、においては、NK細胞を刺激した細胞培養液上清の採取保存は行っているが、サイトカイン測定がまだである。健常者被験者数もさらに増やしたい。
【２】Trogocytosis-based CAR transferにおいては、donor-cell lineの作製は概ね順調であるが、K562-mb15-41BBLをベースにした新たなDonor cell lineの作成は遅れている。とキメラ型受容体Transferの予備実験には成功しているものの、まだ実施回数が不十分である。新たな細胞株については未検討である。今年度、遅れを取戻すことを目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の推進方策については、上記したとおりである。
現時点では計画の変更・見直しは予定していない。
Trogocytosisについては、研究のさらなる発展のために、CAR遺伝子移転後のNK細胞機能解析にさらなる工夫が必要と考えている。今後さらに詳細に検討したい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
計画よりもやや進行が遅れていることで、計画よりも少ない支出となった。
特に、サイトカイン測定などの比較的高額の解析が平成26年度に持越しになったため、支出額が見積もりより小さくなったと思われる。
平成26年度に持ち越された解析（サイトカイン測定など）を行うため、持ち越した費用が使われる予定である。
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